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赵宗江△ 杜磊 赵敬 张新雪 乌格敦其其格 林恬恬
（北京中医药大学基础医学院细胞与生化实验室，北京：100029）
摘要 目的：观察糖肾平胶囊对高糖环境下LPS 刺激足细胞TGF-β1/Smad7 信号转导通路的影响，并探讨
其作用机制。方法：以高糖、LPS 刺激足细胞建立模型，分为正常组、高糖组、高糖+LPS 组、厄贝沙坦
组、糖肾平小、中、大剂量组和抑制剂组。采用western-bloting 方法检测足细胞中TGF-β1、Smad7、NF-κB
的表达。结果：与正常组比，高糖组和高糖+LPS 组足细胞TGF-β1、NF-κB 表达明显升高（p<0.01），Smad7
表达明显降低（p<0.01）；抑制剂组足细胞TGF-β1、NF-κB 蛋白表达比高糖组和高糖+LPS 组均明显降低
第九届世界中医药大会
The 9th World Congress of Chinese Medicine
•27 8•
实 验 研 究
Experimental study
（p<0.01），Smad7 蛋白表达明显升高（p<0.01），厄贝沙坦组TGF-β1 蛋白表达比高糖组和高糖+LPS 组降
低（p<0.05），NF-κB 蛋白表达明显降低（p<0.01），Smad7 蛋白表达明显升高（p<0.01），糖肾平胶囊大、
中、小剂量组足细胞中TGF-β1 蛋白表达比高糖组和高糖+LPS 组均降低（p<0.05），大剂量组足细胞NF-κB
蛋白表达比高糖组和高糖+LPS 组均明显降低（p<0.01），中、小剂量组足细胞NF-κB 蛋白表达比高糖组和
高糖+LPS 组均降低（p<0.05），糖肾平胶囊大、小剂量组Smad7 蛋白表达比高糖组和高糖+LPS 组均明显
升高（p<0.01）。结论：糖肾平能够降低足细胞TGF-β1、NF-κB 蛋白的表达，增加Smad7 蛋白表达，通过
干预TGF-β1-smad7-NF-κB 信号转导通路减少糖尿病肾病足细胞凋亡，可能是其防治糖尿病肾病的作用机
制之一。
关键词 糖肾平胶囊；足细胞；TGF-β1/ Smad7；信号转导通路
Study on the impact of Tnang shen ping in a high glucose environment on LPS-stimulated TGF-β1/Smad7
signaling in podocytes
Zhao Zongjiang△ Du Lei Zao Jing Zhang XinXue WuGeDun Ling Ruby
（Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China）
Abstract Objective: To observe the influence of the capsule of Tang shen ping on LPS-induced TGF-β1/Smad7
signal transduction of podocytes under high glucose conditions, and explore its possible mechanism. Method:
Build the growth model of podocyte induced by LPS in high glucose conditions, and divide them into 8 groups:(1)
control group;(2) high glucose group;(3) high glucose plus LPS group;(4) Irbesartan group;(5) low-dose group of
tangshenping capsule;(6) moderate dose group of tangshenping capsule; (7) high-dose group of tangshenping
capsule;(
inhibitor group. Detect podocyte TGF-β1, Smad7, and NF-κB protein expression of each group by
western-bloting the molecular biology level. Result: Compared with the control group, the expression of podocyte
TGF-β1、NF-κB protein increased definitely (p<0.01), Smad7 protein
decreased definitely (p<0.01) in the high glucose group and high glucose plus LPS groups. In the inhibitor group
podocyte TGF-β1, NF-κB protein expression were significantly lower (p<0.01), while Smad7 protein expression
was significantly higher (p<0.01) than the high glucose group and high glucose plus LPS groups. Compared with
the high glucose group and high glucose plus LPS groups, the expression of podocyte TGF-β1 decreased (p<0.05),
NF-κB protein decreased definitely (p<0.01), and Smad7 protein increased definitely (p<0.01) in the Irbesartan
group; In the high, moderate, and low dose groups of Tangshenping capsule, podocyte TGF-β1 protein expression
decreased (p<0.05); podocyte NF-κB protein expression decreased definitely (p<0.01)in the high -dose group and
decreased (p<0.05) in both moderate and low-dose groups of tangshenping capsule; Smad7 protein increase
definitely (p<0.01) in the high and low dose groups of tangshenping capsule. Conclusion: Tangshenping capsule
can reduce podocyte TGF-β1、NF-κB protein expression and increase Smad7 protein expression, reducing
podocyte apoptosis by intervention of TGF-β1-smad7-NF-κB signaling pathways. This mechanism may be
considered as a means of prevention and treatment for diabetic nephropathy.
Key words Tangshenping capsule; Podocyte; TGF-β1/ Smad7; Signal transduction pathway
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病（diabetes mellitus, DM）患者最常见的微血管并发症
之一，是导致慢性肾衰的主要原因之一。随着人们生活水平的提高和人口的老龄化，DM 的发病率逐年上
升，DN 也随之增加，截止到2010 年我国糖尿病患者约1.71 亿[1]。DN 的发病机制较复杂，至今仍未完全
明确。近年来，作为肾小球滤过屏障结构成分的足细胞在糖尿病肾病发生、发展过程中起着重要作用，足
细胞是肾小球中最容易受到损伤的细胞成分，其形态结构及其相关分子改变在DN 的发生发展中起主要作
用[2-4]。有研究证实糖尿病时，足细胞的凋亡会增加，使肾小球滤过屏障的结构和功能严重受损，从而失去
对蛋白的屏障作用，白蛋白大量漏出，最终导致蛋白尿的发生。
糖肾平胶囊作为中药复方在防治DN 的临床应用中显示出来良好的疗效，并且本实验室通过动物整体
实验证明其对DN 大鼠肾脏有一定的保护作用，可以显著降低DN 大鼠24h 尿蛋白定量。本实验以足细胞
凋亡为切入点，采用western-bloting 检测各组足细胞中TGF-β1、Smad7、NF-κB 蛋白的表达，探讨其作用
机制。
1．材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 细胞 大鼠肾小球足细胞由美国维恩大学医学部张玉祥教授赠送。
1．1．2 药物 糖肾平胶囊（以下简称糖肾平）由生黄芪6g、熟地黄3g、山茱萸2g、牡丹皮3g、地骨
皮3g、水蛭2g 共6 味药物组成，批号：2006008；厄贝沙坦片（赛诺菲安万特，进口药品分装批号：国药
第九届世界中医药大会
The 9th World Congress of Chinese Medicine
•279•
实 验 研 究
Experimental study
准字 J2008061）。
1．1．3 仪器与试剂 超净工作台、空气过滤器（北京市昌平长城空气净化设备公司）；恒温CO2 培
养箱（B5060EK/CO2 德国产）；倒置显微镜（TS-100 NIKON）；胰蛋白酶1∶250（GIBCO，41500-067）；
LPS（Sigma，DH183-10）；甲叉丙烯酰胺（Ameresco 产品批号：2967B040）；甲叉双丙烯酰胺（Ameresco，
1209B293）；组织蛋白提取试剂（康为世纪，16910L），GAPDH（康为世纪，CW-0097），TGF-β1（Santa Cruz，
B2510），Smad7（Santa Cruz，12409）、NF-κB（Santa Cruz，A2411），抗体反应液（康为世纪 HRP，20911J），
Western 一步法试剂盒（康为世纪，CW-20298）。
1．2 实验方法
1．2．1 含药血清的制备 取正常雄性Wistar 大鼠，将糖肾平胶囊小、中、大分别按3.08mg/mL
（1mL/100g）、6.16mg/mL、12.32mg/mL 灌胃给药；厄贝沙坦组按1.75mg/mL 灌胃给药，1 次/d，共7 次。
于第7d 大鼠股动脉取血10mL，离心制备血清，56℃灭活，-20℃冻存备用。
1．2．2 足细胞培养与分组 大鼠肾小球足细胞复苏，于25cm2 细胞培养瓶内加入5mL 含10%胎牛血
清足细胞培养液，置于33℃、5%CO2 细胞培养箱内传代培养。细胞分组：正常组：8% FBS-1640 培养基；
高糖组：8% FBS-1640 培养基+4.5‰ GLU；高糖+LPS 组：8%FBS-1640 培养基+4.5‰ GLU +LPS 1μg/ml%；
厄贝沙坦组：8%含药血清-1640 培养基+4.5‰GLU +LPS 1μg/ml；糖肾平小、中、大：8%含药血清-1640
培养基+4.5‰ GLU +LPS 1μg/mL、抑制剂组：8%FBS-1640 培养基+4.5‰GLU +LPS 1μg/mL +抑制剂
（SB203580）0.5μg。于实验前用将处于对数生长期的各组足细胞用无血清足细胞培养液同步24h，使细胞
处于G0 期后，按细胞分组加入含有含药血清和葡萄糖足细胞培养液孵育48h，然后提取蛋白。
1．2．3 观察指标及检测方法 采用Western-bloting 检测各组足细胞中TGF-β1、Smad7、NF-κB 蛋白
的表达。
1．2．4 图像分析统计 各组图像分析数据用（ x ±s）表示，应用SPSS17.0 统计软件进行统计分析，
组间比较用单因素方差分析，P<0.05 认为组间有统计学差异，P<0.01 认为组间有显著性统计学差异。
2．结果
TGF-β1：高糖组与高糖加LPS 组足细胞内TGF-β1 蛋白表达明显高于正常组，有显著性差异（p<0.01）；
厄贝沙坦组有少量表达，与模型组比有统计学差异（p<0.05）；糖肾平含药血清各治疗组足细胞中表达明显
较少，与模型组比有统计学差异（p<0.05）。（见表1，图1）
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
①正常 ②高糖 ③高糖+LPS ④厄贝沙坦 ⑤糖肾平小⑥糖肾平中 ⑦糖肾平大 ⑧抑制剂
图1 足细胞中TGF-β1 蛋白Western-bloting 电泳图
Smad7 蛋白表达：正常组足细胞中Smad7 蛋白表达明显高于其模型组；厄贝沙坦组较其他各组明显
较多，与模型组比有显著统计学差异（p<0.01）；糖肾平胶囊大、中、小剂量组肾组织中Smad7 蛋白表达
明显高于模型组，且有显著统计学差异（p<0.01）。（见表1，图2）
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
GAPDH 36KD
Smad7 51KD
①正常 ②高糖 ③高糖+LPS ④厄贝沙坦 ⑤糖肾平小⑥糖肾平中 ⑦糖肾平大 ⑧抑制剂
图2 足细胞中Smad7 蛋白Westrern-bloting 电泳图
NF-κB 蛋白表达：正常组足细胞仅有少量NF-κB 表达；高糖+LPS 组明显高于其余各组；厄贝沙坦组
表达明显较低，与高糖+LPS 组比有显著统计学差异（p<0.01）；糖肾平大剂量组表达明显较低，与模型组
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•28 0•
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Experimental study
比较有显著统计学差异（p<0.01）；糖肾平中、小剂量组表达较模型组较低，有统计学差异（p<0.05）。（见
表1，图3）
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
GAPDH 36KD
NF-κB65KD
①正常 ②高糖 ③高糖+LPS ④厄贝沙坦 ⑤糖肾平小⑥糖肾平中 ⑦糖肾平大 ⑧抑制剂
图3 足细胞中NF-κB 蛋白Westrern-bloting 电泳图
表1 糖肾平对DN 大鼠足细胞TGF-β1、Smad7、NF-κB 蛋白表达的影响（光密度比， x ±s）
组别 TGF-β1 Smad7 NF-κB
正常组 0.467±0.002**△△ 0.795±0.022**△△ 0.471±0.020**△△
高糖组 0.731±0.026 0.496±0.008 0.777±0.012
高糖+LPS 组 0.808±0.009** 0.461±0.014 0.853±0.023*
厄贝沙坦组 0.496±0.004**△△ 0.761±0.029**△△ 0.593±0.041**△△
糖肾平小剂量组 0.653±0.002**△△▲▲■ ■ 0.599±0.009**△△▲▲■ ■ 0.701±0.006*△△▲▲■ ■
糖肾平中剂量组 0.594±0.013**△△▲▲■ ■ 0.680±0.010**△△▲■ 0.591±0.027**△△
糖肾平大剂量组 0.492±0.012**△△ 0.760±0.034**△△ 0.536±0.023**△△
抑制剂组 0.475±0.005**△△ 0.793±0.015**△△ 0.496±0.003**△△
注：*与高糖组比较P<0.05，** P<0.01；△与高糖+LPS 组比较P<0.05，△△ P<0.01；▲与厄贝沙坦组比较
P<0.05，▲▲ P<0.01；■与糖肾平大剂量组比较P<0.05，■ ■P<0.01
图4 糖肾平对DN 大鼠足细胞TGF-β1、Smad7、NF-κB 蛋白表达的影响
3．讨论
足细胞是肾小球结构的重要组成部分，足细胞的足突相互交叉构成了肾小球滤过屏障的最后部分[5]。
足细胞超微结构改变及其相关分子表达减少不仅与肾功能损害密切相关，而且可导致肾小球硬化和肾纤维
化[6]。研究认为肾脏炎症反应和足细胞损伤、凋亡是DN 重要的病理改变，有研究发现通过抑制
TGF-β1/Smad3、NF-κB 信号转导通路，可以有效减轻肾脏炎症反应，改善肾小管间质纤维化，降低肾小球
肥大，系膜基质增生，以达到减轻肾脏的损害，减少尿蛋白排泄[7]。TGF-β/Smad、NF-κB 信号通路是目前
已经证实的DN 和肾脏炎症反应的主要信号通路之一[8]，TGF-β1 也是目前已知的在DN 病理变化过程中致
纤维化作用最强的细胞因子[9]。Smad 蛋白是TGF-β 信号通路的主要效应蛋白，TGF-β 与I 型受体结合后，
在胞浆区磷酸化I 型受体并与Smad 蛋白形成复合物，再磷酸化R-Smad，磷酸化的R-Smad 与C-Smad 相
结合形成复合物后进入细胞核。NF-κB 是一种多靶向的细胞因子，参与足细胞内的信号传递，调控多种基
因的表达，其激活可导致多种炎症介质的释放，引发肾脏炎症反应，同时又是一个促凋亡因子。TGF-β/Smad
信号转导通路可以激活NF-κB 的活性，诱导肾脏发生炎症和自身免疫反应，并促进肾脏足细胞凋亡[10]。
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•281•
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Experimental study
Smad7 是抑制性Smads，其MH2 结构域可以与活化的TβR-Ⅰ相结合，阻断R-Smad 与TβR-Ⅰ结合，从而
抑制了R-Smad 磷酸化[11]，阻止TGF-β 受体复合物的形成及转核入位[12、13]，延缓了足细胞凋亡，还可通过
阻止核因子NF-κB/p65 从细胞质到细胞核的转录而减少凋亡。
本实验中采用Western-bloting 方法检测出正常组足细胞内TGF-β1、NF-κB 蛋白的表达明显较低，而
Smad7 蛋白的表达明显较高；高糖组和高糖加LPS 组足细胞内TGF-β1、NF-κB 蛋白的表达明显升高，Smad7
蛋白的表达明显低于正常组。抑制剂SB203580 可以抑制高糖环境下LPS 刺激的足细胞内TGF-β1、NF-κB
蛋白的表达，增加Smad7 蛋白的表达；糖肾平含药血清培养的高糖加LPS 刺激的足细胞内Smad 蛋白表达
明显升高，TGF-β1、NF-κB 蛋白的表达较低，且大剂量组最为显著。
本实验室通过研究证明糖肾平[14]对DN 大鼠有肯定的疗效，而本研究从体外细胞分子水平进一步探索
其作用机制，其机制之一可能为：下调足细胞TGF-β1、NF-κB 蛋白和mRNA 的表达，提高Smad7 蛋白和
mRNA 的表达，调控TGF-β1/Smad7、NF-κB 信号转导通路的激活，降低机体氧化应激水平，减少足细胞
的损伤、凋亡，保护肾小球滤过屏障，改善肾小球蛋白率过滤，减少蛋白尿的发生，减少系膜基质增厚、
积聚，减少胶原纤维的沉积，起到对肾脏的保护作用，延缓DN“肾痿”的病理进程，为“肾痿”理论提供有
力的细胞分子学依据，为其进一步发扬提供必要的实验数据支持。糖肾平作为中药复方对DN 的治疗作用
是多环节、多靶点的，其在分子水平的作用机制值得我们更进一步的深入研究。
参考文献
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摘要 目的：观察糖肾平胶囊对高糖环境下LPS 刺激足细胞TGF-β1/Smad7 信号转导通路的影响，并探讨
其作用机制。方法：以高糖、LPS 刺激足细胞建立模型，分为正常组、高糖组、高糖+LPS 组、厄贝沙坦
组、糖肾平小、中、大剂量组和抑制剂组。采用western-bloting 方法检测足细胞中TGF-β1、Smad7、NF-κB
的表达。结果：与正常组比，高糖组和高糖+LPS 组足细胞TGF-β1、NF-κB 表达明显升高（p<0.01），Smad7
表达明显降低（p<0.01）；抑制剂组足细胞TGF-β1、NF-κB 蛋白表达比高糖组和高糖+LPS 组均明显降低
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（p<0.01），Smad7 蛋白表达明显升高（p<0.01），厄贝沙坦组TGF-β1 蛋白表达比高糖组和高糖+LPS 组降
低（p<0.05），NF-κB 蛋白表达明显降低（p<0.01），Smad7 蛋白表达明显升高（p<0.01），糖肾平胶囊大、
中、小剂量组足细胞中TGF-β1 蛋白表达比高糖组和高糖+LPS 组均降低（p<0.05），大剂量组足细胞NF-κB
蛋白表达比高糖组和高糖+LPS 组均明显降低（p<0.01），中、小剂量组足细胞NF-κB 蛋白表达比高糖组和
高糖+LPS 组均降低（p<0.05），糖肾平胶囊大、小剂量组Smad7 蛋白表达比高糖组和高糖+LPS 组均明显
升高（p<0.01）。结论：糖肾平能够降低足细胞TGF-β1、NF-κB 蛋白的表达，增加Smad7 蛋白表达，通过
干预TGF-β1-smad7-NF-κB 信号转导通路减少糖尿病肾病足细胞凋亡，可能是其防治糖尿病肾病的作用机
制之一。
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Study on the impact of Tnang shen ping in a high glucose environment on LPS-stimulated TGF-β1/Smad7
signaling in podocytes
Zhao Zongjiang△ Du Lei Zao Jing Zhang XinXue WuGeDun Ling Ruby
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Abstract Objective: To observe the influence of the capsule of Tang shen ping on LPS-induced TGF-β1/Smad7
signal transduction of podocytes under high glucose conditions, and explore its possible mechanism. Method:
Build the growth model of podocyte induced by LPS in high glucose conditions, and divide them into 8 groups:(1)
control group;(2) high glucose group;(3) high glucose plus LPS group;(4) Irbesartan group;(5) low-dose group of
tangshenping capsule;(6) moderate dose group of tangshenping capsule; (7) high-dose group of tangshenping
capsule;(
inhibitor group. Detect podocyte TGF-β1, Smad7, and NF-κB protein expression of each group bywestern-bloting the molecular biology level. Result: Compared with the control group, the expression of podocyte
TGF-β1、NF-κB protein increased definitely (p<0.01), Smad7 protein
decreased definitely (p<0.01) in the high glucose group and high glucose plus LPS groups. In the inhibitor group
podocyte TGF-β1, NF-κB protein expression were significantly lower (p<0.01), while Smad7 protein expression
was significantly higher (p<0.01) than the high glucose group and high glucose plus LPS groups. Compared with
the high glucose group and high glucose plus LPS groups, the expression of podocyte TGF-β1 decreased (p<0.05),
NF-κB protein decreased definitely (p<0.01), and Smad7 protein increased definitely (p<0.01) in the Irbesartan
group; In the high, moderate, and low dose groups of Tangshenping capsule, podocyte TGF-β1 protein expression
decreased (p<0.05); podocyte NF-κB protein expression decreased definitely (p<0.01)in the high -dose group and
decreased (p<0.05) in both moderate and low-dose groups of tangshenping capsule; Smad7 protein increase
definitely (p<0.01) in the high and low dose groups of tangshenping capsule. Conclusion: Tangshenping capsule
can reduce podocyte TGF-β1、NF-κB protein expression and increase Smad7 protein expression, reducing
podocyte apoptosis by intervention of TGF-β1-smad7-NF-κB signaling pathways. This mechanism may be
considered as a means of prevention and treatment for diabetic nephropathy.
Key words Tangshenping capsule; Podocyte; TGF-β1/ Smad7; Signal transduction pathway
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病（diabetes mellitus, DM）患者最常见的微血管并发症
之一，是导致慢性肾衰的主要原因之一。随着人们生活水平的提高和人口的老龄化，DM 的发病率逐年上
升，DN 也随之增加，截止到2010 年我国糖尿病患者约1.71 亿[1]。DN 的发病机制较复杂，至今仍未完全
明确。近年来，作为肾小球滤过屏障结构成分的足细胞在糖尿病肾病发生、发展过程中起着重要作用，足
细胞是肾小球中最容易受到损伤的细胞成分，其形态结构及其相关分子改变在DN 的发生发展中起主要作
用[2-4]。有研究证实糖尿病时，足细胞的凋亡会增加，使肾小球滤过屏障的结构和功能严重受损，从而失去
对蛋白的屏障作用，白蛋白大量漏出，最终导致蛋白尿的发生。
糖肾平胶囊作为中药复方在防治DN 的临床应用中显示出来良好的疗效，并且本实验室通过动物整体
实验证明其对DN 大鼠肾脏有一定的保护作用，可以显著降低DN 大鼠24h 尿蛋白定量。本实验以足细胞
凋亡为切入点，采用western-bloting 检测各组足细胞中TGF-β1、Smad7、NF-κB 蛋白的表达，探讨其作用
机制。
1．材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 细胞 大鼠肾小球足细胞由美国维恩大学医学部张玉祥教授赠送。
1．1．2 药物 糖肾平胶囊（以下简称糖肾平）由生黄芪6g、熟地黄3g、山茱萸2g、牡丹皮3g、地骨
皮3g、水蛭2g 共6 味药物组成，批号：2006008；厄贝沙坦片（赛诺菲安万特，进口药品分装批号：国药
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1．1．3 仪器与试剂 超净工作台、空气过滤器（北京市昌平长城空气净化设备公司）；恒温CO2 培
养箱（B5060EK/CO2 德国产）；倒置显微镜（TS-100 NIKON）；胰蛋白酶1∶250（GIBCO，41500-067）；
LPS（Sigma，DH183-10）；甲叉丙烯酰胺（Ameresco 产品批号：2967B040）；甲叉双丙烯酰胺（Ameresco，
1209B293）；组织蛋白提取试剂（康为世纪，16910L），GAPDH（康为世纪，CW-0097），TGF-β1（Santa Cruz，
B2510），Smad7（Santa Cruz，12409）、NF-κB（Santa Cruz，A2411），抗体反应液（康为世纪 HRP，20911J），
Western 一步法试剂盒（康为世纪，CW-20298）。
1．2 实验方法
1．2．1 含药血清的制备 取正常雄性Wistar 大鼠，将糖肾平胶囊小、中、大分别按3.08mg/mL
（1mL/100g）、6.16mg/mL、12.32mg/mL 灌胃给药；厄贝沙坦组按1.75mg/mL 灌胃给药，1 次/d，共7 次。
于第7d 大鼠股动脉取血10mL，离心制备血清，56℃灭活，-20℃冻存备用。
1．2．2 足细胞培养与分组 大鼠肾小球足细胞复苏，于25cm2 细胞培养瓶内加入5mL 含10%胎牛血
清足细胞培养液，置于33℃、5%CO2 细胞培养箱内传代培养。细胞分组：正常组：8% FBS-1640 培养基；
高糖组：8% FBS-1640 培养基+4.5‰ GLU；高糖+LPS 组：8%FBS-1640 培养基+4.5‰ GLU +LPS 1μg/ml%；
厄贝沙坦组：8%含药血清-1640 培养基+4.5‰GLU +LPS 1μg/ml；糖肾平小、中、大：8%含药血清-1640
培养基+4.5‰ GLU +LPS 1μg/mL、抑制剂组：8%FBS-1640 培养基+4.5‰GLU +LPS 1μg/mL +抑制剂
（SB203580）0.5μg。于实验前用将处于对数生长期的各组足细胞用无血清足细胞培养液同步24h，使细胞
处于G0 期后，按细胞分组加入含有含药血清和葡萄糖足细胞培养液孵育48h，然后提取蛋白。
1．2．3 观察指标及检测方法 采用Western-bloting 检测各组足细胞中TGF-β1、Smad7、NF-κB 蛋白
的表达。
1．2．4 图像分析统计 各组图像分析数据用（ x ±s）表示，应用SPSS17.0 统计软件进行统计分析，
组间比较用单因素方差分析，P<0.05 认为组间有统计学差异，P<0.01 认为组间有显著性统计学差异。
2．结果
TGF-β1：高糖组与高糖加LPS 组足细胞内TGF-β1 蛋白表达明显高于正常组，有显著性差异（p<0.01）；
厄贝沙坦组有少量表达，与模型组比有统计学差异（p<0.05）；糖肾平含药血清各治疗组足细胞中表达明显
较少，与模型组比有统计学差异（p<0.05）。（见表1，图1）
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
①正常 ②高糖 ③高糖+LPS ④厄贝沙坦 ⑤糖肾平小⑥糖肾平中 ⑦糖肾平大 ⑧抑制剂
图1 足细胞中TGF-β1 蛋白Western-bloting 电泳图
Smad7 蛋白表达：正常组足细胞中Smad7 蛋白表达明显高于其模型组；厄贝沙坦组较其他各组明显
较多，与模型组比有显著统计学差异（p<0.01）；糖肾平胶囊大、中、小剂量组肾组织中Smad7 蛋白表达
明显高于模型组，且有显著统计学差异（p<0.01）。（见表1，图2）
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
GAPDH 36KD
Smad7 51KD
①正常 ②高糖 ③高糖+LPS ④厄贝沙坦 ⑤糖肾平小⑥糖肾平中 ⑦糖肾平大 ⑧抑制剂
图2 足细胞中Smad7 蛋白Westrern-bloting 电泳图
NF-κB 蛋白表达：正常组足细胞仅有少量NF-κB 表达；高糖+LPS 组明显高于其余各组；厄贝沙坦组
表达明显较低，与高糖+LPS 组比有显著统计学差异（p<0.01）；糖肾平大剂量组表达明显较低，与模型组
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比较有显著统计学差异（p<0.01）；糖肾平中、小剂量组表达较模型组较低，有统计学差异（p<0.05）。（见
表1，图3）
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
GAPDH 36KD
NF-κB65KD
①正常 ②高糖 ③高糖+LPS ④厄贝沙坦 ⑤糖肾平小⑥糖肾平中 ⑦糖肾平大 ⑧抑制剂
图3 足细胞中NF-κB 蛋白Westrern-bloting 电泳图
表1 糖肾平对DN 大鼠足细胞TGF-β1、Smad7、NF-κB 蛋白表达的影响（光密度比， x ±s）
组别 TGF-β1 Smad7 NF-κB
正常组 0.467±0.002**△△ 0.795±0.022**△△ 0.471±0.020**△△
高糖组 0.731±0.026 0.496±0.008 0.777±0.012
高糖+LPS 组 0.808±0.009** 0.461±0.014 0.853±0.023*
厄贝沙坦组 0.496±0.004**△△ 0.761±0.029**△△ 0.593±0.041**△△
糖肾平小剂量组 0.653±0.002**△△▲▲■ ■ 0.599±0.009**△△▲▲■ ■ 0.701±0.006*△△▲▲■ ■
糖肾平中剂量组 0.594±0.013**△△▲▲■ ■ 0.680±0.010**△△▲■ 0.591±0.027**△△
糖肾平大剂量组 0.492±0.012**△△ 0.760±0.034**△△ 0.536±0.023**△△
抑制剂组 0.475±0.005**△△ 0.793±0.015**△△ 0.496±0.003**△△
注：*与高糖组比较P<0.05，** P<0.01；△与高糖+LPS 组比较P<0.05，△△ P<0.01；▲与厄贝沙坦组比较
P<0.05，▲▲ P<0.01；■与糖肾平大剂量组比较P<0.05，■ ■P<0.01
图4 糖肾平对DN 大鼠足细胞TGF-β1、Smad7、NF-κB 蛋白表达的影响
3．讨论
足细胞是肾小球结构的重要组成部分，足细胞的足突相互交叉构成了肾小球滤过屏障的最后部分[5]。
足细胞超微结构改变及其相关分子表达减少不仅与肾功能损害密切相关，而且可导致肾小球硬化和肾纤维
化[6]。研究认为肾脏炎症反应和足细胞损伤、凋亡是DN 重要的病理改变，有研究发现通过抑制
TGF-β1/Smad3、NF-κB 信号转导通路，可以有效减轻肾脏炎症反应，改善肾小管间质纤维化，降低肾小球
肥大，系膜基质增生，以达到减轻肾脏的损害，减少尿蛋白排泄[7]。TGF-β/Smad、NF-κB 信号通路是目前
已经证实的DN 和肾脏炎症反应的主要信号通路之一[8]，TGF-β1 也是目前已知的在DN 病理变化过程中致
纤维化作用最强的细胞因子[9]。Smad 蛋白是TGF-β 信号通路的主要效应蛋白，TGF-β 与I 型受体结合后，
在胞浆区磷酸化I 型受体并与Smad 蛋白形成复合物，再磷酸化R-Smad，磷酸化的R-Smad 与C-Smad 相
结合形成复合物后进入细胞核。NF-κB 是一种多靶向的细胞因子，参与足细胞内的信号传递，调控多种基
因的表达，其激活可导致多种炎症介质的释放，引发肾脏炎症反应，同时又是一个促凋亡因子。TGF-β/Smad
信号转导通路可以激活NF-κB 的活性，诱导肾脏发生炎症和自身免疫反应，并促进肾脏足细胞凋亡[10]。
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Smad7 是抑制性Smads，其MH2 结构域可以与活化的TβR-Ⅰ相结合，阻断R-Smad 与TβR-Ⅰ结合，从而
抑制了R-Smad 磷酸化[11]，阻止TGF-β 受体复合物的形成及转核入位[12、13]，延缓了足细胞凋亡，还可通过
阻止核因子NF-κB/p65 从细胞质到细胞核的转录而减少凋亡。
本实验中采用Western-bloting 方法检测出正常组足细胞内TGF-β1、NF-κB 蛋白的表达明显较低，而
Smad7 蛋白的表达明显较高；高糖组和高糖加LPS 组足细胞内TGF-β1、NF-κB 蛋白的表达明显升高，Smad7
蛋白的表达明显低于正常组。抑制剂SB203580 可以抑制高糖环境下LPS 刺激的足细胞内TGF-β1、NF-κB
蛋白的表达，增加Smad7 蛋白的表达；糖肾平含药血清培养的高糖加LPS 刺激的足细胞内Smad 蛋白表达
明显升高，TGF-β1、NF-κB 蛋白的表达较低，且大剂量组最为显著。
本实验室通过研究证明糖肾平[14]对DN 大鼠有肯定的疗效，而本研究从体外细胞分子水平进一步探索
其作用机制，其机制之一可能为：下调足细胞TGF-β1、NF-κB 蛋白和mRNA 的表达，提高Smad7 蛋白和
mRNA 的表达，调控TGF-β1/Smad7、NF-κB 信号转导通路的激活，降低机体氧化应激水平，减少足细胞
的损伤、凋亡，保护肾小球滤过屏障，改善肾小球蛋白率过滤，减少蛋白尿的发生，减少系膜基质增厚、
积聚，减少胶原纤维的沉积，起到对肾脏的保护作用，延缓DN“肾痿”的病理进程，为“肾痿”理论提供有
力的细胞分子学依据，为其进一步发扬提供必要的实验数据支持。糖肾平作为中药复方对DN 的治疗作用
是多环节、多靶点的，其在分子水平的作用机制值得我们更进一步的深入研究。
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