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刘健2 万磊1 2 程园园2 3 刘磊2 3 冯云霞2 3 黄传兵2 汪元2
(1 湖北中医药大学，湖北武汉，430065；2 安徽中医学院第一附属医院风湿免疫科，安徽合肥，230031；3 安徽中医学院，安徽合肥，230038)
摘要 目的：观察佐剂关节炎(AA)大鼠肺功能降低与肺组织Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2 的关系。
方法：将40 只大鼠随机均分为正常组和模型组,模型组大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(CFA)0.1 mL
致炎,复制成佐剂关节炎模型。致炎30 天后,观察两组大鼠足跖肿胀度、关节炎指数,肺功能,肺组织形态学
变化,RT-PCR 法检测肺组织Notch1、Notch2 及Jagged1、Jagged2 的表达。结果：模型组大鼠足跖肿胀度、
关节炎指数升高,肺功能参数用力肺活量(FVC)、50%肺活量的最大呼气流量(FEF50)、75%肺活量的最大呼
气流量(FEF75)、用力最大呼气流量(PEF)降低,肺组织Notch1、Jagged1、Jagged2 的表达水平降低
(P<0.05,P<0.01)。相关分析显示,模型组大鼠肺功能参数FVC 与Jagged1 呈正相关,FEV1/FVC 与Notch1 呈
正相关,FEF50 与Jagged2 呈正相关,FEF75 与Notch1、Notch2 呈正相关,与Jagged1 呈负相关(P<0.05,P<0.01)。
结论：AA 大鼠在发生关节炎症的同时出现肺功能降低,而肺功能降低与Notch 受体/配体呈高度相关,提示
致炎后形成的免疫复合物沉积于肺组织,激活肺组织Notch 信号通路,通过级联放大效应进一步导致肺功能
降低。
关键词 佐剂关节炎；肺功能；Notch1~2；Jagged1~2
The correlation between changes of pulmonary function and Notch1、Notch2/Jagged1、Jagged2 signaling
pathway in adjuvant arthritis rats
Liu Jian2 Wan Lei1 Cheng Yuanyuan3 et al
(1 Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan，430065;2 The First Hospital Affiliated to Anhui College of
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Experimental study
Tradittional Chinese Medicine, Hefei，230031;3 Anhui College of Traditional Chinese Medicine, Hefei，230038)
Abstract Objective：To evaluate the correlation between decline of pulmonary function and Notch1、
Notch2/Jagged1、Jagged2 signaling pathway in adjuvant arthritis rats(AA rats). Methods：40 AA rats were
randomly divided into normal group and model group. Rats in MC group were induced to AA model by
intradermally injecting 0.1mL Freund's complete adjuvant into the right paw.After 30 days ,to observe paw edema
volume, arthritis index,pulmonary function,histo-morphological changes of pulmonary, and detect the expression
of Notch1、Notch2/Jagged1、Jagged2 by RT-PCR of AA rats.Results：Compare to NC group, paw edema volume,
arthritis index in MC group significantly increased, while FVC,FEF50,FEF75,PEF and the expression of Notch1、
Jagged1、Jagged2 in lungs significantly decreased (P <0.05,P <0.01). The correlation analysis indicated that there
were significant positive correlations between FVC and Jagged1,FEV1/FVC and Notch1,FEF50 and Jagged2;
FEF75 was positively correlated with MAC and MDC respectively,while negatively correlated with Jagged1 (P
<0.05, P <0.01).Conclusion While arthritis occurred in AA rats ,pulmonary function declined and significantly
correlated with the expression of Notch receptor/ligand,suggesting that the deposition of immune complex in
pulmonary following injection of CFA activated the Notch signaling pathway,and resulted in further decline of
pulmonary function by signaling cascades .
Key words Arthritis；Adjuvant；Pulmonary function；Notch1~2；Jagged1~2
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)病理特征是滑膜、血管的慢性炎症,同时出现软骨吸收、骨质破
坏。RA 是一种累及全身病变的自身免疫性疾病,不但出现关节局部的病变,还可以累及到肺、心、肾等其他
组织脏器。由于肺组织的结缔组织和血管丰富,所以肺组织累及的概率更大,随着RA 病程延长,肺受累程度
增大,呈现发病率高的态势。RA 累及肺组织主要病变为肺间质纤维化[1],研究显示[2-3]约有11%的RA 出现肺
间质纤维化改变,而RA 出现肺功能降低的占48%。研究表明[4]AA 大鼠肺功能出现明显降低,而肺功能参数
与肺部高分辨CT(HRCT)、细胞因子呈高度相关,RA 的发展与免疫细胞网络失衡密切相关。最新研究发现
[5-6], Notch 信号途径不仅调控免疫细胞谱系的产生,还参与调节外周成熟免疫细胞进一步分化和功能的发挥,
因此笔者推测,RA 肺功能降低可能与Notch 信号异常表达有关。因此,该研究通过观察AA 大鼠肺组织中
Notch 受体Notch1、Notch2 及配体Jagged1、Jagged2 的表达变化,探讨AA 大鼠肺功能损害的免疫学机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级雄性Wistar 大鼠40 只,鼠龄5~6 月,体质量(165±18.6) g,由南京医科大学实验动物中心提供。清
洁级标准饲养,供试前常规饲养7 d,观察无异常者入组实验。
1.2 药品及试剂
弗氏完全佐剂(CFA)由美国Sigma 公司出品(批号:098k8729);TRIzol-RNA 提取液美国Invitrogen 公司提
供(货号:DP421);M-Mulv Reverse 试剂盒、PCR Master Mix 试剂盒均购自美国Fermentas 公司;引物由上海生
工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 仪器与设备
动物肺功能检测仪由北京贝兰博科技有限公司生产(型号:AniRes2003);电子天平由上海精密仪器仪表
有限公司生产(型号:JA3003N);台式高速冷冻离心机由德国Eppendorf 公司生产(型号:Centrifuge 5417R);PCR
扩增仪由德国Biometra 公司生产(型号:T-Gradient Thermoblock);电泳仪由美国Amersham 公司生产(型
号:EPS-301);凝胶图像分析仪由美国Bio-RAD 公司生产(型号:Gel Doc XR)。
1.4 模型复制与样品采集
将大鼠随机均分为两组:正常组和模型组。向模型组大鼠右后足跖皮内注射CFA 0.1 mL 致炎,制成佐剂
关节炎(Adjuvant Arthritis,AA)模型[7]。致炎30 d 后用10 %水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉,气管切开
后行气管插管,检测大鼠肺功能;处死大鼠, 开胸腔取出肺脏,完整分离出气管和双肺,去除周围结缔组织,取
右肺中叶置于10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋、切片、HE 染色,光镜观察。取大鼠左肺组织约(120±20
mg)装入冻存管,液氮保存备用。
1.5 检测指标
1.5.1 大鼠足跖肿胀度、关节炎指数的测算 足跖肿胀度:分别在造模前1 天、致炎后30 d,每3 天测量
各组大鼠后足跖的容积,计算各组大鼠足跖肿胀度[8]。肿胀度=(Vt-Vn) /Vn×100 % (Vn、Vt 分别代表造模前
后的容积)。关节炎指数的计算:致炎后第15 d 开始观察并记录全身关节病变程度,每3 天一次。全身病变按
5 级评分法评价,根据未注射佐剂的其余3 只肢体的病变程度累积积分,计算出AI[9]。0 分:无红肿; 1 分:小趾
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关节红肿; 2 分:趾关节和足跖肿胀; 3 分:踝关节以下的足爪肿胀; 4 分:包括踝关节在内的全部足爪肿胀。把
各个关节的积分累计起来,即为每只大鼠的AI,最高分为12 分。
1.5.2 肺功能测定 致炎30 d 后,用动物肺功能仪测定肺功能。测定指标有用力肺活量(FVC)、1 秒内平
均呼气流量(FEV1 / FVC)、25%肺活量的最大呼气流量(FEF25)、50%肺活量的最大呼气流量 (FEF50)、75%
肺活量的最大呼气流量(FEF75)、最大呼气中期流量 (MMF)、用力最大呼气流量(PEF)。操作过程: 10%水合
氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉,气管切开后行气管插管,将大鼠置于体描箱内,保持头低位,与呼吸机管路
相连,行机械通气测肺功能。在测定过程中,采用外加压力的办法,使动物深吸气、深呼气,频率为25:10,电脑
自动快速检测出各项肺功能参数指标。
1.5.3 大鼠肺病理组织学观察 将肺组织于4 %多聚甲醛中固定8 h 后予脱水、透明、浸蜡和包埋,并切
片(6 μm)作HE 染色,光镜观察。
1.5.4 大鼠肺组织Notch1、Notch2 mRNA 及Jagged1、Jagged2 的表达 引物的设计与合成:根据
GenBank 提供的序列号,使用Primer Premier 5 软件设计并分析引物。序列见表1。mRNA 检测步骤:大鼠肺
组织用匀浆器匀浆,用TRIzol 试剂盒提取肺组织总RNA。总RNA 按照M-Mulv 反转录试剂盒说明书提供
的方法进行反转录。PCR 反应体系为50 μL,包括反转录产物3 μL,正、反向引物各1 μL 及Go Taq DNA 聚
合酶混合液25 μL,水补足至50 μL。反应条件为95℃预变性5 min,然后进行35 个循环的反应,每一循环包括
变性(94℃)30 s,退火(Notch1:54℃、Notch2:55℃、Jagged1:56℃、Jagged2:56℃、β-actin:60℃)40 s,延伸(72℃)60
s,最后72℃延伸10 min,4℃终止。扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶中进行电泳,电压为110 V,时间为60 min。利
用Bio-Rad 凝胶图像分析仪装置进行照相,Image-Pro Plus 软件对条带进行分析,计算各电泳条带光密度
(IOD),以Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2 分别与β-actin IOD 比值作为各指标mRNA 表达的相对含量。
表1 Notch 受体及配体引物序列与预扩增长度
基因名称 引物序列 扩增长度(bp)
Notch1 上游 5’-TCA TCT CCG ACT TCA TCT ATC A-3’
下游 5’-TGC AGA GCT GAC TTG CCT A-3’
373
Notch2 上游 5’-ATA GGC TCT AAG GTA TTT CTG G-3’
下游 5’-CAA TGC TCG CTT GTC GTG-3’ 419
Jagged1 上游 5’-GCT TCG GCT CAG GGT CTA-3’
下游 5’-AGT CAC CTG GGA GTT TGC-3’ 474
Jagged2 上游 5’-GGG CTC TTG CCA CGA AGT-3’
下游 5’-AGG CAC GGT TTC CCT TCA-3’ 222
β-actin 上游 5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TAG-3’
下游 5’-CCA CAG TCC ATG CCA TCAC T-3’
450
1.6 统计学处理
采用 SPSS 11.5 软件进行统计学处理,变量用x s表示,两组间比较采用独立样本 t 检验;相关性分析采
用多元相关分析。
2 结果
2.1 2 组大鼠一般情况变化
模型复制12 h 后,模型组大鼠右后足趾关节红肿,局部伴溃烂;12 d 后,模型大鼠出现四肢关节红肿、溃烂,
皮毛干枯、稀疏,蜷缩少动, 眯眼、呆滞、精神萎靡,反应迟钝,有不同程度的耸毛,体质量下降,饮食饮水量下
降;25 d 后四肢关节红肿明显,毛发失去光泽,竖毛明显,懒动,扎堆,精神倦怠甚至萎靡,体质量明显下降,饮食
饮水量明显下降,大便稀溏，偶有呼吸气促现象。正常无上述症状,见图1。
A:模型组,B:正常组
图1:两组大鼠足趾变化情况
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2.2 2组大鼠体质量、足跖肿胀度、关节炎指数的变化
致炎前各组大鼠的体质量无差异;模型复制后,与正常组比较,模型组大鼠致炎12 d后体质量出现下降;致
炎15 d足跖肿胀度达最高峰,后逐渐下降;致炎12 d模型组大鼠左后足趾、部分双前足趾开始出现红肿,致炎25
d达高峰,后逐渐下降,见表2。
表 2 2 组大鼠体质量、足跖肿胀度和关节炎指数的比较(n=20, x s )
体质量 (g) 足跖肿胀度 (%) 关节炎指数 (分) 组 别
致炎0 d 致炎12 d 致炎48 d 致炎18 d 致炎48 d 致炎12 d 致炎48 d
正常 180±12.8 215±14.6 311±10.8 3.6±2.0 7.5±3.7 0.12±0.20 0.17±0.30
模型 183±14.5 201±13.6 248±12.9** 27.9±10.6** 16.7±13.2** 1.14±0.60** 7.19±2.20**
与正常组比较: **P <0.01
2.3 2 组肺功能的比较
与正常组相比, 模型组FVC 、FEF50、FEF75 、PEF 明显降低,FEV1/FVC 明显升高(P <0.01)。见表3。
表 3 2 组大鼠肺功能比较(n=20, x s )
肺功能参数 正常组 模型组
FVC 38.2±3.3 26.7±2.9 **
FEV1/FVC(%) 57.9±5.7 68.6±6.3**
FEF25 (ml/ s) 41.4±10.8 38.7±11.4
FEF50 (ml/ s) 39.6±9.8 32.7±7.2*
FEF75 (ml/ s) 36.4±8.5 26.4±9.6 **
MMF (ml/ s) 33.7±13.5 32.6±9.4
PEF (ml/ s) 40.2±6.8 31.4±5.6 **
与正常组比较:*P <0.05, **P <0.01
2.4 2 组大鼠肺组织的形态学改变
正常组大鼠肺组织结构清晰,未出现明显形态学改变;模型组大鼠肺组织中肺泡结构不规整,肺泡腔萎缩
或消失,部分呈肺实变;肺间隔增宽,肺间质可见大量炎细胞浸润, 炎性细胞占细胞总数的比例为47.2%,炎细
胞以中性粒细胞为主,少见淋巴细胞和巨噬细胞,偶见成纤维细胞增殖,见图2。
A:正常组, B:模型组
图2 大鼠肺组织形态学观察 HE x200
2.5 两组大鼠肺组织Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2 mRNA 的变化
模型组大鼠肺组织Notch1、Jagged1、Jagged2 较正常组明显降低(P <0.01); Notch2 的表达升高,但无统
计学意义(P >0.05)。见表4,图3。
表 4 各组大鼠 Notch 受体、配体的比较(n=6, x s )
指标 正常组 模型组
Notch1 mRNA 0.67±0.25 0.42±0.19 **
Notch2 mRNA 0.52±0.31 0.54±0.22
Jagged1 mRNA 0.58±0.22 0.33±0.14 **
Jagged2 mRNA 0.56±0.34 0.40±0.21 **
与正常组比较: *P <0.05, **P <0.01
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1:正常组, 2:模型组
A:Jagged1; B:Jagged2; C:Notch1;D:Notch2; E:β-actin
图3:大鼠肺组织Notch 受体、配体的表达
2.6 AA 大鼠肺功能与Notch 受体、配体相关性分析
相关分析结果显示,AA 大鼠肺功能参数FVC 与Jagged1 呈正相关,FEV1/FVC 与Notch1 呈正相关,FEF50
与Jagged2 呈正相关,FEF75 与Notch1、Notch2 呈正相关,与Jagged1 呈负相关(P <0.05 或P <0.01),见表5。
表5 AA 大鼠肺功能参数与Notch 受体、配体的关系 (n=20,r)
指 标 FVC FEV1/FVC FEF25 FEF50 FEF75 MMF PEF
Notch1mRNA 0.202 0.448** 0.167 0.219 0.402﹡ -0.143 -0.071
Notch2mRNA 0.135 -0.095 -0.143 0.167 -0.343* 0.064 -0.057
Jagged1mRNA 0.379* 0.229 -0.193 -0.099 -0.235 -0.104 -0.118
Jagged2mRNA 0.257 0.301 0.314 0.396* 0.291 0.108 0.122
*P <0.05, **P <0.01
3 讨 论
Notch 信号是通过介导碱式螺旋-回旋-螺旋转录因子表达,调控肺泡上皮和血管内皮细胞的增殖、分化
等,对肺组织的发育和维持功能起重要作用[10]。在佐剂致炎的AA 大鼠中,致炎后所形成的免疫复合物沉积
于关节局部,导致发生关节炎症持续出现关节局部的红肿和溃烂。而佐剂致炎复制的AA 大鼠模型是全身、
多系统的反应,致炎后同样也会出现肺组织局部免疫复合物的形成和沉积[11]。有研究表明[12],免疫复合物的
形成和沉积与补体调节蛋白密切相关,活化的转录因子调控一系列炎性反应相关因子的表达,形成瀑布级链
效应,导致肺损伤过程[13]。
该研究显示,与正常组相比,模型组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数升高,而肺功能参数出现下降,说明佐剂
致炎后不但出现关节局部的炎症反应,而且还会导致其他组织脏器如肺组织出现损伤,肺组织损伤表现为肺
功能的下降,进一步观察发现,肺功能参数FVC、FEF50、FEF75、PEF 降低,提示AA 大鼠肺功能降低以小气
道的受阻为主,同时伴有一定程度通气功能的下降。通过RT-PCR 对肺组织Notch 受体Notch1、2 和Notch
配体Jagged1、Jagged2 检测发现,肺组织Notch1、Jagged1、Jagged2mRNA 的表达水平降低。说明在AA 大
鼠肺组织Notch 通路受体Notch1 与其配体结合,进一步调节T 细胞免疫,导致免疫功能的紊乱,出现炎症的持
续反应,导致肺组织的损伤,故出现肺组织中肺泡结构不规整,肺泡腔萎缩或消失,部分呈肺实变;肺间质可见
大量炎细胞浸润和成纤维细胞增殖。为进一步研究和肺功能降低的关系,通过相关分析显示,AA 大鼠肺功能
参数FVC 与Jagged1 呈正相关,FEV1/FVC 与Notch1 呈正相关,FEF50 与Jagged2 呈正相关,FEF75 与Notch1、
Notch2 呈正相关,与Jagged1 呈负相关。说明Notch1、Notch2 与Jagged1、Jagged2 结合,导致Notch 信号通
路的激活,Notch 受体与配体结合作用于邻近细胞,进一步参与T 细胞的增值、活化,从而导致肺组织的损伤,
从而最终出现肺功能的降低。
Notch 是一个在进化上十分保守的跨膜受体蛋白家族,通过Notch 配体与受体的相互作用而转导信号,
精确地调控各谱系细胞的分化,对于生物体细胞的分化,增殖和凋亡起着重要的作用[14-16]。Notch1、Notch3
广泛表达于呼吸道上皮细胞、肺泡上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞及肺间质细胞[17]。Ⅱ型肺泡上皮细胞
(AECⅡ)是肺内主要干细胞,正常肺泡上皮更新和肺损伤修复的唯一途径是AECⅡ通过增殖并向Ⅰ型肺泡
上皮细胞(AECⅠ)转分化[18-20],使肺泡壁重新上皮化以恢复气血屏障的重要功能。在佐剂致炎后,异常表达的
Notch 信号可能导致AECⅡ和血管内皮细胞的增殖、分化失调控[21-22]。AECⅡ分泌肺表面活性物质及转分
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化功能异常致使AECⅠ数量进一步减少、肺泡表面张力增高,肺泡萎陷,出现肺泡通气/换气功能障碍,最终出
现肺功能参数FVC、FEV1、FEF25、FEF50、MMF、PEF 等降低,使AA 大鼠肺功能损害。
RA 致肺病变发病过程的具体作用环节极为复杂, Notch 受体与配体如何调节通路对细胞免疫的调
节,Notch 的其他受体如Notch3、Notch4 和受体Delta1 等是否也参与其调节作用,同时AECⅠ、AECⅡ是如
何参与肺功能降低的过程还将进一步研究。
参考文献
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关节炎指数升高,肺功能参数用力肺活量(FVC)、50%肺活量的最大呼气流量(FEF50)、75%肺活量的最大呼
气流量(FEF75)、用力最大呼气流量(PEF)降低,肺组织Notch1、Jagged1、Jagged2 的表达水平降低
(P<0.05,P<0.01)。相关分析显示,模型组大鼠肺功能参数FVC 与Jagged1 呈正相关,FEV1/FVC 与Notch1 呈
正相关,FEF50 与Jagged2 呈正相关,FEF75 与Notch1、Notch2 呈正相关,与Jagged1 呈负相关(P<0.05,P<0.01)。
结论：AA 大鼠在发生关节炎症的同时出现肺功能降低,而肺功能降低与Notch 受体/配体呈高度相关,提示
致炎后形成的免疫复合物沉积于肺组织,激活肺组织Notch 信号通路,通过级联放大效应进一步导致肺功能
降低。
关键词 佐剂关节炎；肺功能；Notch1~2；Jagged1~2
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实 验 研 究
Experimental study
Tradittional Chinese Medicine, Hefei，230031;3 Anhui College of Traditional Chinese Medicine, Hefei，230038)
Abstract Objective：To evaluate the correlation between decline of pulmonary function and Notch1、
Notch2/Jagged1、Jagged2 signaling pathway in adjuvant arthritis rats(AA rats). Methods：40 AA rats were
randomly divided into normal group and model group. Rats in MC group were induced to AA model by
intradermally injecting 0.1mL Freund's complete adjuvant into the right paw.After 30 days ,to observe paw edema
volume, arthritis index,pulmonary function,histo-morphological changes of pulmonary, and detect the expression
of Notch1、Notch2/Jagged1、Jagged2 by RT-PCR of AA rats.Results：Compare to NC group, paw edema volume,
arthritis index in MC group significantly increased, while FVC,FEF50,FEF75,PEF and the expression of Notch1、
Jagged1、Jagged2 in lungs significantly decreased (P <0.05,P <0.01). The correlation analysis indicated that there
were significant positive correlations between FVC and Jagged1,FEV1/FVC and Notch1,FEF50 and Jagged2;
FEF75 was positively correlated with MAC and MDC respectively,while negatively correlated with Jagged1 (P
<0.05, P <0.01).Conclusion While arthritis occurred in AA rats ,pulmonary function declined and significantly
correlated with the expression of Notch receptor/ligand,suggesting that the deposition of immune complex in
pulmonary following injection of CFA activated the Notch signaling pathway,and resulted in further decline of
pulmonary function by signaling cascades .
Key words Arthritis；Adjuvant；Pulmonary function；Notch1~2；Jagged1~2
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)病理特征是滑膜、血管的慢性炎症,同时出现软骨吸收、骨质破
坏。RA 是一种累及全身病变的自身免疫性疾病,不但出现关节局部的病变,还可以累及到肺、心、肾等其他
组织脏器。由于肺组织的结缔组织和血管丰富,所以肺组织累及的概率更大,随着RA 病程延长,肺受累程度
增大,呈现发病率高的态势。RA 累及肺组织主要病变为肺间质纤维化[1],研究显示[2-3]约有11%的RA 出现肺
间质纤维化改变,而RA 出现肺功能降低的占48%。研究表明[4]AA 大鼠肺功能出现明显降低,而肺功能参数
与肺部高分辨CT(HRCT)、细胞因子呈高度相关,RA 的发展与免疫细胞网络失衡密切相关。最新研究发现
[5-6], Notch 信号途径不仅调控免疫细胞谱系的产生,还参与调节外周成熟免疫细胞进一步分化和功能的发挥,
因此笔者推测,RA 肺功能降低可能与Notch 信号异常表达有关。因此,该研究通过观察AA 大鼠肺组织中
Notch 受体Notch1、Notch2 及配体Jagged1、Jagged2 的表达变化,探讨AA 大鼠肺功能损害的免疫学机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级雄性Wistar 大鼠40 只,鼠龄5~6 月,体质量(165±18.6) g,由南京医科大学实验动物中心提供。清
洁级标准饲养,供试前常规饲养7 d,观察无异常者入组实验。
1.2 药品及试剂
弗氏完全佐剂(CFA)由美国Sigma 公司出品(批号:098k8729);TRIzol-RNA 提取液美国Invitrogen 公司提
供(货号:DP421);M-Mulv Reverse 试剂盒、PCR Master Mix 试剂盒均购自美国Fermentas 公司;引物由上海生
工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 仪器与设备
动物肺功能检测仪由北京贝兰博科技有限公司生产(型号:AniRes2003);电子天平由上海精密仪器仪表
有限公司生产(型号:JA3003N);台式高速冷冻离心机由德国Eppendorf 公司生产(型号:Centrifuge 5417R);PCR
扩增仪由德国Biometra 公司生产(型号:T-Gradient Thermoblock);电泳仪由美国Amersham 公司生产(型
号:EPS-301);凝胶图像分析仪由美国Bio-RAD 公司生产(型号:Gel Doc XR)。
1.4 模型复制与样品采集
将大鼠随机均分为两组:正常组和模型组。向模型组大鼠右后足跖皮内注射CFA 0.1 mL 致炎,制成佐剂
关节炎(Adjuvant Arthritis,AA)模型[7]。致炎30 d 后用10 %水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉,气管切开
后行气管插管,检测大鼠肺功能;处死大鼠, 开胸腔取出肺脏,完整分离出气管和双肺,去除周围结缔组织,取
右肺中叶置于10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋、切片、HE 染色,光镜观察。取大鼠左肺组织约(120±20
mg)装入冻存管,液氮保存备用。
1.5 检测指标
1.5.1 大鼠足跖肿胀度、关节炎指数的测算 足跖肿胀度:分别在造模前1 天、致炎后30 d,每3 天测量
各组大鼠后足跖的容积,计算各组大鼠足跖肿胀度[8]。肿胀度=(Vt-Vn) /Vn×100 % (Vn、Vt 分别代表造模前
后的容积)。关节炎指数的计算:致炎后第15 d 开始观察并记录全身关节病变程度,每3 天一次。全身病变按
5 级评分法评价,根据未注射佐剂的其余3 只肢体的病变程度累积积分,计算出AI[9]。0 分:无红肿; 1 分:小趾
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关节红肿; 2 分:趾关节和足跖肿胀; 3 分:踝关节以下的足爪肿胀; 4 分:包括踝关节在内的全部足爪肿胀。把
各个关节的积分累计起来,即为每只大鼠的AI,最高分为12 分。
1.5.2 肺功能测定 致炎30 d 后,用动物肺功能仪测定肺功能。测定指标有用力肺活量(FVC)、1 秒内平
均呼气流量(FEV1 / FVC)、25%肺活量的最大呼气流量(FEF25)、50%肺活量的最大呼气流量 (FEF50)、75%
肺活量的最大呼气流量(FEF75)、最大呼气中期流量 (MMF)、用力最大呼气流量(PEF)。操作过程: 10%水合
氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉,气管切开后行气管插管,将大鼠置于体描箱内,保持头低位,与呼吸机管路
相连,行机械通气测肺功能。在测定过程中,采用外加压力的办法,使动物深吸气、深呼气,频率为25:10,电脑
自动快速检测出各项肺功能参数指标。
1.5.3 大鼠肺病理组织学观察 将肺组织于4 %多聚甲醛中固定8 h 后予脱水、透明、浸蜡和包埋,并切
片(6 μm)作HE 染色,光镜观察。
1.5.4 大鼠肺组织Notch1、Notch2 mRNA 及Jagged1、Jagged2 的表达 引物的设计与合成:根据
GenBank 提供的序列号,使用Primer Premier 5 软件设计并分析引物。序列见表1。mRNA 检测步骤:大鼠肺
组织用匀浆器匀浆,用TRIzol 试剂盒提取肺组织总RNA。总RNA 按照M-Mulv 反转录试剂盒说明书提供
的方法进行反转录。PCR 反应体系为50 μL,包括反转录产物3 μL,正、反向引物各1 μL 及Go Taq DNA 聚
合酶混合液25 μL,水补足至50 μL。反应条件为95℃预变性5 min,然后进行35 个循环的反应,每一循环包括
变性(94℃)30 s,退火(Notch1:54℃、Notch2:55℃、Jagged1:56℃、Jagged2:56℃、β-actin:60℃)40 s,延伸(72℃)60
s,最后72℃延伸10 min,4℃终止。扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶中进行电泳,电压为110 V,时间为60 min。利
用Bio-Rad 凝胶图像分析仪装置进行照相,Image-Pro Plus 软件对条带进行分析,计算各电泳条带光密度
(IOD),以Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2 分别与β-actin IOD 比值作为各指标mRNA 表达的相对含量。
表1 Notch 受体及配体引物序列与预扩增长度
基因名称 引物序列 扩增长度(bp)
Notch1 上游 5’-TCA TCT CCG ACT TCA TCT ATC A-3’
下游 5’-TGC AGA GCT GAC TTG CCT A-3’
373
Notch2 上游 5’-ATA GGC TCT AAG GTA TTT CTG G-3’
下游 5’-CAA TGC TCG CTT GTC GTG-3’ 419
Jagged1 上游 5’-GCT TCG GCT CAG GGT CTA-3’
下游 5’-AGT CAC CTG GGA GTT TGC-3’ 474
Jagged2 上游 5’-GGG CTC TTG CCA CGA AGT-3’
下游 5’-AGG CAC GGT TTC CCT TCA-3’ 222
β-actin 上游 5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TAG-3’
下游 5’-CCA CAG TCC ATG CCA TCAC T-3’
450
1.6 统计学处理
采用 SPSS 11.5 软件进行统计学处理,变量用x s表示,两组间比较采用独立样本 t 检验;相关性分析采
用多元相关分析。
2 结果
2.1 2 组大鼠一般情况变化
模型复制12 h 后,模型组大鼠右后足趾关节红肿,局部伴溃烂;12 d 后,模型大鼠出现四肢关节红肿、溃烂,
皮毛干枯、稀疏,蜷缩少动, 眯眼、呆滞、精神萎靡,反应迟钝,有不同程度的耸毛,体质量下降,饮食饮水量下
降;25 d 后四肢关节红肿明显,毛发失去光泽,竖毛明显,懒动,扎堆,精神倦怠甚至萎靡,体质量明显下降,饮食
饮水量明显下降,大便稀溏，偶有呼吸气促现象。正常无上述症状,见图1。
A:模型组,B:正常组
图1:两组大鼠足趾变化情况
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2.2 2组大鼠体质量、足跖肿胀度、关节炎指数的变化
致炎前各组大鼠的体质量无差异;模型复制后,与正常组比较,模型组大鼠致炎12 d后体质量出现下降;致
炎15 d足跖肿胀度达最高峰,后逐渐下降;致炎12 d模型组大鼠左后足趾、部分双前足趾开始出现红肿,致炎25
d达高峰,后逐渐下降,见表2。
表 2 2 组大鼠体质量、足跖肿胀度和关节炎指数的比较(n=20, x s )
体质量 (g) 足跖肿胀度 (%) 关节炎指数 (分) 组 别
致炎0 d 致炎12 d 致炎48 d 致炎18 d 致炎48 d 致炎12 d 致炎48 d
正常 180±12.8 215±14.6 311±10.8 3.6±2.0 7.5±3.7 0.12±0.20 0.17±0.30
模型 183±14.5 201±13.6 248±12.9** 27.9±10.6** 16.7±13.2** 1.14±0.60** 7.19±2.20**
与正常组比较: **P <0.01
2.3 2 组肺功能的比较
与正常组相比, 模型组FVC 、FEF50、FEF75 、PEF 明显降低,FEV1/FVC 明显升高(P <0.01)。见表3。
表 3 2 组大鼠肺功能比较(n=20, x s )
肺功能参数 正常组 模型组
FVC 38.2±3.3 26.7±2.9 **
FEV1/FVC(%) 57.9±5.7 68.6±6.3**
FEF25 (ml/ s) 41.4±10.8 38.7±11.4
FEF50 (ml/ s) 39.6±9.8 32.7±7.2*
FEF75 (ml/ s) 36.4±8.5 26.4±9.6 **
MMF (ml/ s) 33.7±13.5 32.6±9.4
PEF (ml/ s) 40.2±6.8 31.4±5.6 **
与正常组比较:*P <0.05, **P <0.01
2.4 2 组大鼠肺组织的形态学改变
正常组大鼠肺组织结构清晰,未出现明显形态学改变;模型组大鼠肺组织中肺泡结构不规整,肺泡腔萎缩
或消失,部分呈肺实变;肺间隔增宽,肺间质可见大量炎细胞浸润, 炎性细胞占细胞总数的比例为47.2%,炎细
胞以中性粒细胞为主,少见淋巴细胞和巨噬细胞,偶见成纤维细胞增殖,见图2。
A:正常组, B:模型组
图2 大鼠肺组织形态学观察 HE x200
2.5 两组大鼠肺组织Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2 mRNA 的变化
模型组大鼠肺组织Notch1、Jagged1、Jagged2 较正常组明显降低(P <0.01); Notch2 的表达升高,但无统
计学意义(P >0.05)。见表4,图3。
表 4 各组大鼠 Notch 受体、配体的比较(n=6, x s )
指标 正常组 模型组
Notch1 mRNA 0.67±0.25 0.42±0.19 **
Notch2 mRNA 0.52±0.31 0.54±0.22
Jagged1 mRNA 0.58±0.22 0.33±0.14 **
Jagged2 mRNA 0.56±0.34 0.40±0.21 **
与正常组比较: *P <0.05, **P <0.01
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1:正常组, 2:模型组
A:Jagged1; B:Jagged2; C:Notch1;D:Notch2; E:β-actin
图3:大鼠肺组织Notch 受体、配体的表达
2.6 AA 大鼠肺功能与Notch 受体、配体相关性分析
相关分析结果显示,AA 大鼠肺功能参数FVC 与Jagged1 呈正相关,FEV1/FVC 与Notch1 呈正相关,FEF50
与Jagged2 呈正相关,FEF75 与Notch1、Notch2 呈正相关,与Jagged1 呈负相关(P <0.05 或P <0.01),见表5。
表5 AA 大鼠肺功能参数与Notch 受体、配体的关系 (n=20,r)
指 标 FVC FEV1/FVC FEF25 FEF50 FEF75 MMF PEF
Notch1mRNA 0.202 0.448** 0.167 0.219 0.402﹡ -0.143 -0.071
Notch2mRNA 0.135 -0.095 -0.143 0.167 -0.343* 0.064 -0.057
Jagged1mRNA 0.379* 0.229 -0.193 -0.099 -0.235 -0.104 -0.118
Jagged2mRNA 0.257 0.301 0.314 0.396* 0.291 0.108 0.122
*P <0.05, **P <0.01
3 讨 论
Notch 信号是通过介导碱式螺旋-回旋-螺旋转录因子表达,调控肺泡上皮和血管内皮细胞的增殖、分化
等,对肺组织的发育和维持功能起重要作用[10]。在佐剂致炎的AA 大鼠中,致炎后所形成的免疫复合物沉积
于关节局部,导致发生关节炎症持续出现关节局部的红肿和溃烂。而佐剂致炎复制的AA 大鼠模型是全身、
多系统的反应,致炎后同样也会出现肺组织局部免疫复合物的形成和沉积[11]。有研究表明[12],免疫复合物的
形成和沉积与补体调节蛋白密切相关,活化的转录因子调控一系列炎性反应相关因子的表达,形成瀑布级链
效应,导致肺损伤过程[13]。
该研究显示,与正常组相比,模型组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数升高,而肺功能参数出现下降,说明佐剂
致炎后不但出现关节局部的炎症反应,而且还会导致其他组织脏器如肺组织出现损伤,肺组织损伤表现为肺
功能的下降,进一步观察发现,肺功能参数FVC、FEF50、FEF75、PEF 降低,提示AA 大鼠肺功能降低以小气
道的受阻为主,同时伴有一定程度通气功能的下降。通过RT-PCR 对肺组织Notch 受体Notch1、2 和Notch
配体Jagged1、Jagged2 检测发现,肺组织Notch1、Jagged1、Jagged2mRNA 的表达水平降低。说明在AA 大
鼠肺组织Notch 通路受体Notch1 与其配体结合,进一步调节T 细胞免疫,导致免疫功能的紊乱,出现炎症的持
续反应,导致肺组织的损伤,故出现肺组织中肺泡结构不规整,肺泡腔萎缩或消失,部分呈肺实变;肺间质可见
大量炎细胞浸润和成纤维细胞增殖。为进一步研究和肺功能降低的关系,通过相关分析显示,AA 大鼠肺功能
参数FVC 与Jagged1 呈正相关,FEV1/FVC 与Notch1 呈正相关,FEF50 与Jagged2 呈正相关,FEF75 与Notch1、
Notch2 呈正相关,与Jagged1 呈负相关。说明Notch1、Notch2 与Jagged1、Jagged2 结合,导致Notch 信号通
路的激活,Notch 受体与配体结合作用于邻近细胞,进一步参与T 细胞的增值、活化,从而导致肺组织的损伤,
从而最终出现肺功能的降低。
Notch 是一个在进化上十分保守的跨膜受体蛋白家族,通过Notch 配体与受体的相互作用而转导信号,
精确地调控各谱系细胞的分化,对于生物体细胞的分化,增殖和凋亡起着重要的作用[14-16]。Notch1、Notch3
广泛表达于呼吸道上皮细胞、肺泡上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞及肺间质细胞[17]。Ⅱ型肺泡上皮细胞
(AECⅡ)是肺内主要干细胞,正常肺泡上皮更新和肺损伤修复的唯一途径是AECⅡ通过增殖并向Ⅰ型肺泡
上皮细胞(AECⅠ)转分化[18-20],使肺泡壁重新上皮化以恢复气血屏障的重要功能。在佐剂致炎后,异常表达的
Notch 信号可能导致AECⅡ和血管内皮细胞的增殖、分化失调控[21-22]。AECⅡ分泌肺表面活性物质及转分
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化功能异常致使AECⅠ数量进一步减少、肺泡表面张力增高,肺泡萎陷,出现肺泡通气/换气功能障碍,最终出
现肺功能参数FVC、FEV1、FEF25、FEF50、MMF、PEF 等降低,使AA 大鼠肺功能损害。
RA 致肺病变发病过程的具体作用环节极为复杂, Notch 受体与配体如何调节通路对细胞免疫的调
节,Notch 的其他受体如Notch3、Notch4 和受体Delta1 等是否也参与其调节作用,同时AECⅠ、AECⅡ是如
何参与肺功能降低的过程还将进一步研究。
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