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周学平 周玲玲 柳璋璞 刘天阳 陈晨 周聪 陆燕
（南京中医药大学第一临床医学院，南京市仙林大道138 号，210046）
摘要 目的：建立关节炎大鼠滑膜成纤维细胞和单核细胞共培养诱生破骨样细胞的方法，探讨清络通痹颗
粒抑制破骨样细胞分化、增殖的作用机制。方法：取佐剂性关节炎大鼠外周血单核细胞和滑膜组织，将滑
膜成纤维细胞和单核细胞共培养诱生破骨样细胞；制备清络通痹颗粒含药血清，加入共培养体系，观察其
对破骨样细胞培养上清中M-CSF、IL-34、RANKL 水平和破骨样细胞表达p-ERK 的影响。结果：关节炎
大鼠滑膜成纤维细胞和外周血单核细胞共培养可诱生出破骨样细胞；清络通痹颗粒3.6、7.2、14.4g·kg-1 给
药的大鼠含药血清可不同程度降低破骨样细胞培养上清中M-CSF、IL-34 和RANKL 的水平，并可抑制破
骨样细胞表达p-ERK。结论：清络通痹颗粒可能通过降低破骨细胞分化的正调控因子M-CSF、IL-34 和
RANKL 水平，进一步抑制ERK 的磷酸化，从而抑制破骨细胞的分化、增殖和活性。
关键词 清络通痹颗粒；类风湿关节炎；破骨细胞；共培养；细胞因子
Mechanisms of Qingluotongbi Granule on Osteoclast-like Cells Induced by Co-culturing Synovial
Fibroblasts and Monocytes
Zhou Xue-ping, Zhou Ling-ling, Liu Zhang-pu, Liu Tian-yang,
Chen Chen, Zhou Cong, Lu Yan
(Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing, 210046)
Abstracts Objective: To set up the method for inducing osteoclast-like cells by co-culturing synovial fibroblasts
and monocytes of arthritic rats and study the mechanisms of Qingluotongbi granule (QLT) on the differentiation
and activity of the osteoclast-like cells. Methods: The monocytes of peripheral blood and synovial tissue from
adjuvant-induced arthritic rats were separated, and synovial fibroblasts and monocytes were co-cultured to induce
osteoclast-like cells. QLT-containing sera were obtained and added to the co-cultured system, and the levels of
M-CSF, IL-34 and RANKL were detected. The expression of p-ERK of osteoclast-like cells was also detected.
Results: Co-culturing synovial fibroblasts and monocytes could induce osteoclast-like cells. QLT-containing sera
could reduce the levels of M-CSF, IL-34 and RANKL in the supernatants. QLT-containing sera could also inhibit
the expression of p-ERK. Conclusion: QLT could inhibit the differentiation, proliferation and activity of
osteoclast-like cells by its inhibiting the overproduction of cytokines in the co-culturing system and then
inhibiting the activation of ERK.
Keywords Qingluotongbi granule(QLT)；Rheumatoid arthritis；Osteoclast；Co-culture；Cytokine
类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种以关节滑膜慢性炎症为特征的自身免疫性疾病。在
RA 早期即可发生骨质破坏，而破骨细胞（OC）是RA 骨质破坏中的关键细胞，其分化和活性与白细胞介
第九届世界中医药大会
The 9th World Congress of Chinese Medicine
·227·
实 验 研 究
Experimental study
素-1（Interleukin, IL-1）、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子相关，而破骨细胞分化因子
（Osteoclast differentiation factor / Receptor activator of NF-κB ligand, ODF / RANKL）、巨噬细胞集落刺激
因子（Macrophage colony- Stimulating factor, M-CSF）是刺激破骨前体细胞融合和向成熟破骨细胞分化的关
键细胞因子[1-2]。近年来研究发现的细胞因子IL-34 可完全替代M-CSF 在RANKL 介导的破骨细胞成熟中
的作用。这些细胞因子参与多条信号转导通路的调控，对破骨细胞的分化起着重要的作用。
根据周仲瑛教授经验方研制的清络通痹颗粒（Qingluotongbi granule, QLT）临床治疗RA 疗效确切，
在前期的系列研究中证实了QLT 可调控细胞因子的分泌和抑制滑膜炎症，减轻佐剂性关节炎（Adjunvant
induced arthritis, AIA）大鼠骨质破坏，进一步的研究发现其可抑制乳鼠破骨细胞和共培养诱生的破骨样细
胞的分化、增殖和活性[3-5]。因此，拟深入探讨其抑制破骨细胞分化和活性的机制。
1. 实验材料和方法
1.1 实验动物 SD 大鼠，雄性，180~220g，由南京中医药大学动物中心提供，合格证号：SYXK（苏）
2012—0003。
1.2 药品与试剂 清络通痹颗粒（QLT）：由南京中医药大学植物药深加工工程中心提供（生地黄、清风
藤、川断、露蜂房、鬼箭羽等组成），含3g 生药/mL。雷公藤多苷片（TⅡ）：浙江得思德制药有限公司。
淋巴细胞分离液：中国医学科学院生物工程研究所。胰蛋白酶：Amresco 公司。1,25(OH)2D3：Sigma 公司
产品，以培养液配成1μmol/mL 的母液，用时稀释至终浓度10-7mol/L。链霉蛋白酶E：Merck 公司产品。
Transwell 细胞小室：0.4μm 膜孔径的PET 板，Corning 公司产品。大鼠ELISA 检测试剂盒：ADL 公司产
品。一抗p-ERK，二抗（羊抗小鼠 IgG-HRP）：Jackson 公司产品。内参一抗（β-Actin）：Santa cruze 产品。
Western-blotting 试剂盒：南京赛研生物技术有限公司。
1.3 QLT 含药血清的制备[3] SD 大鼠40 只，雄性，分5 组，每组8 只。即1)正常对照组；2)阳性对
照组：TⅡ7.5 mg·kg-1；3)QLT 小剂量组3.6g（生药）·kg-1；4)QLT 中剂量组7.2g（生药）·kg-1；5)QLT 大剂
量组14.4g（生药）·kg-1。各组按10mL·kg-1 连续灌胃给药，正常对照组给予等体积生理盐水。连续给药7
天，末次给药后1h 取血，离心获含药血清。
1.4 AIA 滑膜成纤维细胞与单核细胞共培养模型的建立[4] 参照文献，30 只SD 雄性大鼠，大鼠右后足
跖皮内注射CFA 0.05 mL/只，另取10 只大鼠作为正常对照组，以等体积生理盐水同部位注射，饲养28 天。
取新鲜抗凝血，分离、培养单核细胞。大鼠处死后取关节滑膜组织，分离滑膜成纤维细胞，培养后传代。
24 孔板内加入106/mL 单核细胞，将传代至3～5 代的滑膜成纤维细胞制备成105/mL 细胞悬液加入24
孔培养板内的悬挂式Transwell 小室内，加入1,25(OH)2D3（10-7mol/L），置5％CO2 培养箱37℃培养，培养
3 周后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鉴定，倒置显微镜下观察，TRAP+部位呈棕红色颗粒。
1.5 破骨样细胞培养上清细胞因子水平检测 5％CO2 、37℃单核细胞和滑膜成纤维细胞共培养1 周，
加入1:10 稀释不同剂量组的QLT 含药血清和正常对照血清，培养48h，取出Transwell 小室，收集下层的
上清液，ELISA 法检测上清液中M-CSF、IL-34 和RANKL 的水平。
1.6 破骨样细胞p-ERK 表达检测 5％CO2 、37℃单核细胞和滑膜成纤维细胞共培养1 周，加入1:10
稀释不同剂量组的QLT 含药血清和正常对照血清，培养48h，取出Transwell 小室，收集破骨样细胞，
Western-blotting 检测其磷酸化的胞外信号调节激酶（p-ERK）表达情况。
1.7 统计方法 实验数据用均数±标准差( x s )表示，计量资料进行单因素方差(ANOVA)分析比较各组
间的差异，采用SPSS 11.5 统计学软件进行。
2、实验结果
2.1 破骨细胞形态学观察及鉴定 共培养约2 周左右，形成破骨细胞样形态，部分细胞成簇生长。3 周
后行TRAP 染色，细胞胞浆呈棕红色颗粒状，核为阴性，核仁清晰。如图1 所示。
A 分化前 (100×) B 分化中(100×) C 分化后(200×) D TRAP 染色(200×)
第九届世界中医药大会
The 9th World Congress of Chinese Medicine
·22 8·
实 验 研 究
Experimental study
图1 AIA 大鼠单核细胞和滑膜成纤维细胞共培养的生长情况及TRAP 染色
Fig1 Monocytes of AIA rat was co- cultivated with synovial fibroblasts and
TRAP identification and bone absorption were conducted
2.2 QLT 对破骨样细胞培养上清M-CSF 水平的影响 见表1。表1 结果显示，QLT 不同剂量给药的大
鼠含药血清可抑制共培养诱生破骨样细胞体系的培养上清液中M-CSF 的水平，与对照组比较有统计学意
义（P<0.05）。
表 1 QLT 含药血清对破骨样细胞培养上清 M-CSF水平的影响( x s ,n=4)
Tab1 Effects of QLT-containing sera on the levels of M-CSF
in supernatants of osteo-like cells ( x s ,n=4)
Group
Dose
（g.kg-1）
M-CSF
（pg/ml）
Control —— 13.00±1.18
TⅡ 7.5mg·kg-1 10.90±1.53
QLT 3.6 12.23±0.58
QLT 7.2 10.71±0.72*
QLT 14.4 10.31±0.62*
*P<0.05 **P<0.01 vs control
2.3 QLT 对破骨样细胞培养上清IL-34 水平的影响 见表2。表2 结果显示，QLT 不同剂量给药的大
鼠含药血清可抑制共培养诱生破骨样细胞体系的培养上清液中IL-34 的水平，与对照组比较有统计学意义
（P<0.05 或0.01）。
表 2 QLT 含药血清对破骨样细胞培养上清 IL-34水平的影响( x s ,n=4)
Tab2 Effects of QLT-containing sera on the levels of IL-34
in supernatants of osteo-like cells ( x s ,n=4)
Group
Dose
（g.kg-1）
IL-34
（pg/ml）
Control —— 93.53±0.90
TⅡ 7.5mg.kg-1 86.87±1.74*
QLT 3.6 84.17±0.90*
QLT 7.2 76.26±0.87**
QLT 14.4 90.85±1.15*
*P<0.05 **P<0.01 vs control
2.4 QLT 对破骨样细胞培养上清RANKL 水平的影响 见表3。表3 结果显示，QLT 不同剂量给药的
大鼠含药血清可抑制共培养诱生破骨样细胞体系的培养上清液中RANKL 的水平，与对照组比较有统计学
意义（P<0.05 或0.01）。
表 3 QLT 含药血清对破骨样细胞培养上清 RANKL 水平的影响( x s ,n=4)
Tab3 Effects of QLT-containing sera on the levels of RANKL
in supernatants of osteo-like cells ( x s ,n=4)
Group
Dose
（g.kg-1）
RANKL
（pg/ml）
Control —— 25.83±4.01
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The 9th World Congress of Chinese Medicine
·229·
实 验 研 究
Experimental study
TⅡ 7.5mg.kg-1 8.97±1.49**
QLT 3.6 18.32±2.14
QLT 7.2 13.13±1.86*
QLT 14.4 7.55±0.55**
*P<0.05 **P<0.01 vs control
2.5 QLT 对破骨样细胞p-ERK 表达的影响 见图2 和表4。图2 和表4 结果显示：QLT 不同剂量给药的大
鼠含药血清可抑制共培养诱生破骨样细胞的p-ERK 表达，以高剂量组抑制作用最为明显。
ß-actin
A Control B TⅡ7.5mg.kg-1 C QLT14.4g.kg-1 D QLT7.2g.kg-1 E QLT3.6 g.kg-1
图2 QLT 对共培养诱生的破骨样细胞p-ERK 表达的影响
Fig2 Effects of QLT-containing sera on p-ERK expression of osteo-like cells
表 4 QLT 含药血清对破骨样细胞 p-ERK表达灰度的影响( x s )
Tab4 Effects of QLT-containing sera on on p-ERK expression
of osteo-like cells ( x s )
Group
Dose
（g.kg-1）
Positive/ß-actin
Control —— 1.103±0.159
TⅡ 7.5mg.kg-1 0.603±0.079*
QLT 3.6 0.650±0.163*
QLT 7.2 0.640±0.238
QLT 14.4 0.367±0.131**
*P<0.05 **P<0.01 vs control
3、讨论
目前的研究认为RA 的骨质破坏由破骨细胞介导的骨吸收过度活跃所引起，破骨细胞分化与淋巴细胞
的异常活化、滑膜炎症密切相关。RA 滑膜组织中CD4+T 细胞与单核细胞、滑膜细胞形成复杂的功能网络，
释放IL-1、TNF-α、IL-17 等促炎性细胞因子，诱导了RANKL 的表达[6]，引起滑膜细胞增殖和骨质破坏。
在细胞因子网络中，M-CSF、 IL-34 和RANKL 是刺激破骨前体细胞融合和向成熟破骨细胞分化的关键细
胞因子[7-8]，通过信号传导通路，介导破骨细胞的成熟、分化和活性。
本实验采用AIA 大鼠滑膜成纤维细胞和外周血单核细胞共培养，成功诱导出破骨样细胞，其TRAP
染色阳性，有骨吸收的能力，具有破骨细胞的一般特征。共培养细胞模型能反映RA 滑膜炎症和骨质破坏
之间的内在联系，提示滑膜成纤维细胞所分泌的细胞因子可刺激破骨细胞前体细胞分化为破骨细胞，体现
RA 的病理过程，适用于药物的作用机制研究。
IL-34 和M-CSF 是破骨细胞分化过程中的重要因子，可共同介导RANKL 的表达及与RANK 结合，对
破骨细胞进行调控，影响其生成、分化、活化的多个环节[9]。从而进一步影响破骨细胞的分化。QLT 含药
血清可以明显抑制破骨样细胞共培养上清中的M-CSF、IL-34、RANKL 的水平，提示QLT 可抑制共培养
体系中的关键性细胞因子水平，从而抑制共培养中破骨细胞的分化、增殖和活性。
研究显示RANKL 可通过影响多条信号通路而影响破骨细胞的分化和活性，课题组前期的研究结果也
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·23 0·
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Experimental study
显示RANKL 可通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路而影响破骨细胞分化[10]。MAPK 通路在破骨细胞
分化过程中起着重要作用，其中，对细胞的增殖与生存起着关键作用的ERK 是整个通路中重要的一环，
ERK 蛋白的磷酸化对于细胞的生存、分化和凋亡都有重要作用。在各种生长因子等作用下ERK 通过磷酸
化途径而被激活形成p-ERK，进一步调控破骨细胞的分化和增殖。本研究结果显示：QLT 含药血清可明显
抑制共培养诱生的破骨样细胞p-ERK 的表达，提示QLT 可抑制ERK 蛋白的磷酸化而抑制破骨细胞的分化，
而其抑制作用可能和抑制RANKL 的表达有关。
综合上述结果，提示QLT 抑制破骨细胞分化和活性的机制可能是通过降低破骨细胞分化的正调控因子
M-CSF、IL-34 等，减少RANKL 的表达，进一步抑制ERK 的磷酸化，从而抑制破骨细胞的分化、增殖和
活性。
参考文献
[1] Acosta-Rodriguez EV, Napolitani G,, Lanzavecchia A, et al. Interleukins 1β and 6 but not transforming gorwth factor-βare essential for the differentiation of
interleukin 17-producing human T helper cells.Nat Immunol, 2007, 8: 942–949.
[2] Scott DL, Kingsley GH, Tunor neerosis factor inhibitors for rheumatoid arthritis.N Engl J Med, 2006,355:704-712.
[3] 周玲玲, 梁晓雯, 周学平, 等. 清络通痹颗粒含药血清对破骨细胞骨吸收的影响, 中国实验方剂学杂志，2011；17（22）：168-71.
[4] 周玲玲, 柳璋璞, 周学平, 等. 清络通痹颗粒对滑膜成纤维细胞与单核细胞共培养诱生的破骨样细胞的影响, 中国免疫学杂志，2011, 27: 988-92.
[5] 周玲玲, 方泰惠, 周学平. 清络通痹颗粒给药的关节炎大鼠滑膜上清对软骨细胞的影响. 福建中医药, 2005, 36(6): 53-55.
[6] Rossa C, Ehmann K, LiuM, et al. MKK3/6-p38 MAPKsignaling is required for IL-1beta and TNF-alpha-induced RANKL expression in bone
marrowstromal cells. Interferon Cytokine Res, 2006, 26(10):719-29.
[7] Ross FP，Teitelbaum SL. Avß3 and macrophage colony- stimulating factor: Partners in osteoclast biology. Immunol Rev, 2005, 208(l):88-105.
[8] Chen Z, Buki K, Vääräniemi J, et al. Väänänen HK. The Critical Role of IL-34 in Osteoclastogenesis. The critical role of IL-34 in osteoclastogenesis. P LoS
One, 2011, 6(4): e18689 (ISSN: 1932-6203)
[9] Jones DH, Kong YY, Penninger JM, et al. Role of RANKL and RANK in bone loss and arthritis. Ann Rheum Dis, 2002, 61: 32-39.
[10] HuangH, Chang EJ, Ryu J, et al. Induction of c-Fos and NFATc1 during RANKL-stimulated osteoclast differentiation ismediated by the p38 signaling
pathway. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 351(1): 99-105.
（南京中医药大学第一临床医学院，南京市仙林大道138 号，210046）
摘要 目的：建立关节炎大鼠滑膜成纤维细胞和单核细胞共培养诱生破骨样细胞的方法，探讨清络通痹颗
粒抑制破骨样细胞分化、增殖的作用机制。方法：取佐剂性关节炎大鼠外周血单核细胞和滑膜组织，将滑
膜成纤维细胞和单核细胞共培养诱生破骨样细胞；制备清络通痹颗粒含药血清，加入共培养体系，观察其
对破骨样细胞培养上清中M-CSF、IL-34、RANKL 水平和破骨样细胞表达p-ERK 的影响。结果：关节炎
大鼠滑膜成纤维细胞和外周血单核细胞共培养可诱生出破骨样细胞；清络通痹颗粒3.6、7.2、14.4g·kg-1 给
药的大鼠含药血清可不同程度降低破骨样细胞培养上清中M-CSF、IL-34 和RANKL 的水平，并可抑制破
骨样细胞表达p-ERK。结论：清络通痹颗粒可能通过降低破骨细胞分化的正调控因子M-CSF、IL-34 和
RANKL 水平，进一步抑制ERK 的磷酸化，从而抑制破骨细胞的分化、增殖和活性。
关键词 清络通痹颗粒；类风湿关节炎；破骨细胞；共培养；细胞因子
Mechanisms of Qingluotongbi Granule on Osteoclast-like Cells Induced by Co-culturing Synovial
Fibroblasts and Monocytes
Zhou Xue-ping, Zhou Ling-ling, Liu Zhang-pu, Liu Tian-yang,
Chen Chen, Zhou Cong, Lu Yan
(Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing, 210046)
Abstracts Objective: To set up the method for inducing osteoclast-like cells by co-culturing synovial fibroblasts
and monocytes of arthritic rats and study the mechanisms of Qingluotongbi granule (QLT) on the differentiation
and activity of the osteoclast-like cells. Methods: The monocytes of peripheral blood and synovial tissue from
adjuvant-induced arthritic rats were separated, and synovial fibroblasts and monocytes were co-cultured to induce
osteoclast-like cells. QLT-containing sera were obtained and added to the co-cultured system, and the levels of
M-CSF, IL-34 and RANKL were detected. The expression of p-ERK of osteoclast-like cells was also detected.
Results: Co-culturing synovial fibroblasts and monocytes could induce osteoclast-like cells. QLT-containing sera
could reduce the levels of M-CSF, IL-34 and RANKL in the supernatants. QLT-containing sera could also inhibit
the expression of p-ERK. Conclusion: QLT could inhibit the differentiation, proliferation and activity of
osteoclast-like cells by its inhibiting the overproduction of cytokines in the co-culturing system and then
inhibiting the activation of ERK.
Keywords Qingluotongbi granule(QLT)；Rheumatoid arthritis；Osteoclast；Co-culture；Cytokine
类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种以关节滑膜慢性炎症为特征的自身免疫性疾病。在
RA 早期即可发生骨质破坏，而破骨细胞（OC）是RA 骨质破坏中的关键细胞，其分化和活性与白细胞介
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素-1（Interleukin, IL-1）、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子相关，而破骨细胞分化因子
（Osteoclast differentiation factor / Receptor activator of NF-κB ligand, ODF / RANKL）、巨噬细胞集落刺激
因子（Macrophage colony- Stimulating factor, M-CSF）是刺激破骨前体细胞融合和向成熟破骨细胞分化的关
键细胞因子[1-2]。近年来研究发现的细胞因子IL-34 可完全替代M-CSF 在RANKL 介导的破骨细胞成熟中
的作用。这些细胞因子参与多条信号转导通路的调控，对破骨细胞的分化起着重要的作用。
根据周仲瑛教授经验方研制的清络通痹颗粒（Qingluotongbi granule, QLT）临床治疗RA 疗效确切，
在前期的系列研究中证实了QLT 可调控细胞因子的分泌和抑制滑膜炎症，减轻佐剂性关节炎（Adjunvant
induced arthritis, AIA）大鼠骨质破坏，进一步的研究发现其可抑制乳鼠破骨细胞和共培养诱生的破骨样细
胞的分化、增殖和活性[3-5]。因此，拟深入探讨其抑制破骨细胞分化和活性的机制。
1. 实验材料和方法
1.1 实验动物 SD 大鼠，雄性，180~220g，由南京中医药大学动物中心提供，合格证号：SYXK（苏）
2012—0003。
1.2 药品与试剂 清络通痹颗粒（QLT）：由南京中医药大学植物药深加工工程中心提供（生地黄、清风
藤、川断、露蜂房、鬼箭羽等组成），含3g 生药/mL。雷公藤多苷片（TⅡ）：浙江得思德制药有限公司。
淋巴细胞分离液：中国医学科学院生物工程研究所。胰蛋白酶：Amresco 公司。1,25(OH)2D3：Sigma 公司
产品，以培养液配成1μmol/mL 的母液，用时稀释至终浓度10-7mol/L。链霉蛋白酶E：Merck 公司产品。
Transwell 细胞小室：0.4μm 膜孔径的PET 板，Corning 公司产品。大鼠ELISA 检测试剂盒：ADL 公司产
品。一抗p-ERK，二抗（羊抗小鼠 IgG-HRP）：Jackson 公司产品。内参一抗（β-Actin）：Santa cruze 产品。
Western-blotting 试剂盒：南京赛研生物技术有限公司。
1.3 QLT 含药血清的制备[3] SD 大鼠40 只，雄性，分5 组，每组8 只。即1)正常对照组；2)阳性对
照组：TⅡ7.5 mg·kg-1；3)QLT 小剂量组3.6g（生药）·kg-1；4)QLT 中剂量组7.2g（生药）·kg-1；5)QLT 大剂
量组14.4g（生药）·kg-1。各组按10mL·kg-1 连续灌胃给药，正常对照组给予等体积生理盐水。连续给药7
天，末次给药后1h 取血，离心获含药血清。
1.4 AIA 滑膜成纤维细胞与单核细胞共培养模型的建立[4] 参照文献，30 只SD 雄性大鼠，大鼠右后足
跖皮内注射CFA 0.05 mL/只，另取10 只大鼠作为正常对照组，以等体积生理盐水同部位注射，饲养28 天。
取新鲜抗凝血，分离、培养单核细胞。大鼠处死后取关节滑膜组织，分离滑膜成纤维细胞，培养后传代。
24 孔板内加入106/mL 单核细胞，将传代至3～5 代的滑膜成纤维细胞制备成105/mL 细胞悬液加入24
孔培养板内的悬挂式Transwell 小室内，加入1,25(OH)2D3（10-7mol/L），置5％CO2 培养箱37℃培养，培养
3 周后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鉴定，倒置显微镜下观察，TRAP+部位呈棕红色颗粒。
1.5 破骨样细胞培养上清细胞因子水平检测 5％CO2 、37℃单核细胞和滑膜成纤维细胞共培养1 周，
加入1:10 稀释不同剂量组的QLT 含药血清和正常对照血清，培养48h，取出Transwell 小室，收集下层的
上清液，ELISA 法检测上清液中M-CSF、IL-34 和RANKL 的水平。
1.6 破骨样细胞p-ERK 表达检测 5％CO2 、37℃单核细胞和滑膜成纤维细胞共培养1 周，加入1:10
稀释不同剂量组的QLT 含药血清和正常对照血清，培养48h，取出Transwell 小室，收集破骨样细胞，
Western-blotting 检测其磷酸化的胞外信号调节激酶（p-ERK）表达情况。
1.7 统计方法 实验数据用均数±标准差( x s )表示，计量资料进行单因素方差(ANOVA)分析比较各组
间的差异，采用SPSS 11.5 统计学软件进行。
2、实验结果
2.1 破骨细胞形态学观察及鉴定 共培养约2 周左右，形成破骨细胞样形态，部分细胞成簇生长。3 周
后行TRAP 染色，细胞胞浆呈棕红色颗粒状，核为阴性，核仁清晰。如图1 所示。
A 分化前 (100×) B 分化中(100×) C 分化后(200×) D TRAP 染色(200×)
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Experimental study
图1 AIA 大鼠单核细胞和滑膜成纤维细胞共培养的生长情况及TRAP 染色
Fig1 Monocytes of AIA rat was co- cultivated with synovial fibroblasts and
TRAP identification and bone absorption were conducted
2.2 QLT 对破骨样细胞培养上清M-CSF 水平的影响 见表1。表1 结果显示，QLT 不同剂量给药的大
鼠含药血清可抑制共培养诱生破骨样细胞体系的培养上清液中M-CSF 的水平，与对照组比较有统计学意
义（P<0.05）。
表 1 QLT 含药血清对破骨样细胞培养上清 M-CSF水平的影响( x s ,n=4)
Tab1 Effects of QLT-containing sera on the levels of M-CSF
in supernatants of osteo-like cells ( x s ,n=4)
Group
Dose
（g.kg-1）
M-CSF
（pg/ml）
Control —— 13.00±1.18
TⅡ 7.5mg·kg-1 10.90±1.53
QLT 3.6 12.23±0.58
QLT 7.2 10.71±0.72*
QLT 14.4 10.31±0.62*
*P<0.05 **P<0.01 vs control
2.3 QLT 对破骨样细胞培养上清IL-34 水平的影响 见表2。表2 结果显示，QLT 不同剂量给药的大
鼠含药血清可抑制共培养诱生破骨样细胞体系的培养上清液中IL-34 的水平，与对照组比较有统计学意义
（P<0.05 或0.01）。
表 2 QLT 含药血清对破骨样细胞培养上清 IL-34水平的影响( x s ,n=4)
Tab2 Effects of QLT-containing sera on the levels of IL-34
in supernatants of osteo-like cells ( x s ,n=4)
Group
Dose
（g.kg-1）
IL-34
（pg/ml）
Control —— 93.53±0.90
TⅡ 7.5mg.kg-1 86.87±1.74*
QLT 3.6 84.17±0.90*
QLT 7.2 76.26±0.87**
QLT 14.4 90.85±1.15*
*P<0.05 **P<0.01 vs control
2.4 QLT 对破骨样细胞培养上清RANKL 水平的影响 见表3。表3 结果显示，QLT 不同剂量给药的
大鼠含药血清可抑制共培养诱生破骨样细胞体系的培养上清液中RANKL 的水平，与对照组比较有统计学
意义（P<0.05 或0.01）。
表 3 QLT 含药血清对破骨样细胞培养上清 RANKL 水平的影响( x s ,n=4)
Tab3 Effects of QLT-containing sera on the levels of RANKL
in supernatants of osteo-like cells ( x s ,n=4)
Group
Dose
（g.kg-1）
RANKL
（pg/ml）
Control —— 25.83±4.01
第九届世界中医药大会
The 9th World Congress of Chinese Medicine
·229·
实 验 研 究
Experimental study
TⅡ 7.5mg.kg-1 8.97±1.49**
QLT 3.6 18.32±2.14
QLT 7.2 13.13±1.86*
QLT 14.4 7.55±0.55**
*P<0.05 **P<0.01 vs control
2.5 QLT 对破骨样细胞p-ERK 表达的影响 见图2 和表4。图2 和表4 结果显示：QLT 不同剂量给药的大
鼠含药血清可抑制共培养诱生破骨样细胞的p-ERK 表达，以高剂量组抑制作用最为明显。
ß-actin
A Control B TⅡ7.5mg.kg-1 C QLT14.4g.kg-1 D QLT7.2g.kg-1 E QLT3.6 g.kg-1
图2 QLT 对共培养诱生的破骨样细胞p-ERK 表达的影响
Fig2 Effects of QLT-containing sera on p-ERK expression of osteo-like cells
表 4 QLT 含药血清对破骨样细胞 p-ERK表达灰度的影响( x s )
Tab4 Effects of QLT-containing sera on on p-ERK expression
of osteo-like cells ( x s )
Group
Dose
（g.kg-1）
Positive/ß-actin
Control —— 1.103±0.159
TⅡ 7.5mg.kg-1 0.603±0.079*
QLT 3.6 0.650±0.163*
QLT 7.2 0.640±0.238
QLT 14.4 0.367±0.131**
*P<0.05 **P<0.01 vs control
3、讨论
目前的研究认为RA 的骨质破坏由破骨细胞介导的骨吸收过度活跃所引起，破骨细胞分化与淋巴细胞
的异常活化、滑膜炎症密切相关。RA 滑膜组织中CD4+T 细胞与单核细胞、滑膜细胞形成复杂的功能网络，
释放IL-1、TNF-α、IL-17 等促炎性细胞因子，诱导了RANKL 的表达[6]，引起滑膜细胞增殖和骨质破坏。
在细胞因子网络中，M-CSF、 IL-34 和RANKL 是刺激破骨前体细胞融合和向成熟破骨细胞分化的关键细
胞因子[7-8]，通过信号传导通路，介导破骨细胞的成熟、分化和活性。
本实验采用AIA 大鼠滑膜成纤维细胞和外周血单核细胞共培养，成功诱导出破骨样细胞，其TRAP
染色阳性，有骨吸收的能力，具有破骨细胞的一般特征。共培养细胞模型能反映RA 滑膜炎症和骨质破坏
之间的内在联系，提示滑膜成纤维细胞所分泌的细胞因子可刺激破骨细胞前体细胞分化为破骨细胞，体现
RA 的病理过程，适用于药物的作用机制研究。
IL-34 和M-CSF 是破骨细胞分化过程中的重要因子，可共同介导RANKL 的表达及与RANK 结合，对
破骨细胞进行调控，影响其生成、分化、活化的多个环节[9]。从而进一步影响破骨细胞的分化。QLT 含药
血清可以明显抑制破骨样细胞共培养上清中的M-CSF、IL-34、RANKL 的水平，提示QLT 可抑制共培养
体系中的关键性细胞因子水平，从而抑制共培养中破骨细胞的分化、增殖和活性。
研究显示RANKL 可通过影响多条信号通路而影响破骨细胞的分化和活性，课题组前期的研究结果也
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实 验 研 究
Experimental study
显示RANKL 可通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路而影响破骨细胞分化[10]。MAPK 通路在破骨细胞
分化过程中起着重要作用，其中，对细胞的增殖与生存起着关键作用的ERK 是整个通路中重要的一环，
ERK 蛋白的磷酸化对于细胞的生存、分化和凋亡都有重要作用。在各种生长因子等作用下ERK 通过磷酸
化途径而被激活形成p-ERK，进一步调控破骨细胞的分化和增殖。本研究结果显示：QLT 含药血清可明显
抑制共培养诱生的破骨样细胞p-ERK 的表达，提示QLT 可抑制ERK 蛋白的磷酸化而抑制破骨细胞的分化，
而其抑制作用可能和抑制RANKL 的表达有关。
综合上述结果，提示QLT 抑制破骨细胞分化和活性的机制可能是通过降低破骨细胞分化的正调控因子
M-CSF、IL-34 等，减少RANKL 的表达，进一步抑制ERK 的磷酸化，从而抑制破骨细胞的分化、增殖和
活性。
参考文献
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