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王伟钢 晏铭洋
(中日友好医院国际医疗部一病区,100029)
摘要 目的：评价补肾祛寒治尪汤全方对胶原诱导型关节炎模型（CIA）大鼠骨质破坏的影响及机制。方
法：将大鼠随机分为6 组：正常组、模型组、甲氨喋呤（MTX）组，补肾祛寒治尪汤全方小剂量组、中剂
量组和高剂量组。各用药组给药28 天，观察各组大鼠的一般情况，体重变化，制作大鼠膝关节病理切片
（HE 染色，TRAP 染色计数破骨细胞和OPG/RANKL 免疫组化染色），并在光镜下观察其形态同时进行
半定量分析。结果：1）较模型组，全方中、小剂量组及MTX 组均能改善大鼠的一般情况和体重变化情况，
中剂量组效果最佳。2）HE 染色：较模型组，用药可以改善大鼠关节病理异常，主要表现在减少新生血管
和关节软骨破坏方面，中剂量组效果最明显（P<0.01）。3）TRAP 染色：较模型组，中、高剂量组的TRAP
（＋）细胞数量均明显减少（P<0.01）。4）RANKL 免疫组化：模型、MTX、小剂量和高剂量组的阳性表
达都较正常组明显升高（P<0.01）；中剂量组阳性表达在数值上有升高；各用药组的阳性表达都较模型组
在数值上有降低。结论：1）补肾祛寒治尪汤可延缓CIA 大鼠膝关节的骨质破坏；考虑是通过影响
OPG/RANK/RANKL 系统来抑制破骨细胞活性。2）中剂量中药组效果最佳。
关键词 类风湿关节炎/ 中医药疗法；@补肾祛寒治尪汤； 骨破坏； 破骨细胞； 实验研究；
OPG/RANK/RANKL。
Abstract Objective: To evaluate the effect of “ Bu shen qu han zhi wang” decoction on bone destruction of CIA
rats, and to investigate the possible mechanism. Methods : Groups of rats with Collagen Ⅱ-induced Arthritis(CIA)
were treated with methotrexate, low-dose , usual-dose and high-dose herbal medicine from day 7 to the end of
experiment(day 35) . The nomal rats and CIA rats without medicine intervention as the control groups .To
obeserve the symptoms and weight rats, and the left knee were then removed for histopathology , including HE
staining , TRAP staining for OC(osteoclast) and Immunohistochemical staining of OPG/RANKL. Besides, to
evaluate semi-quantitative analysis for the histopathological slides. Results :Compared with the model group ,
MTX and different doses herbal medicine groups have effects on the symptoms , changes of weights and
histopathologically qualitative and quantitative analyses of CIA rats . There is a certain dose-effect relationship ,
in which the usual-dose herbal medicine group has the best effect , compared with other groups of CIA rats.
Conclusions :The usual-dose “ Bu shen qu han zhi wang ” decoction can improve symptoms and postpone the
bone destruction of CIA rats . We suggest that the possible mechanism of this progress could be a suppression of
osteoclasts through OPG/RANK/RANKL .
Key words Rheumatoid arthritis/Chinese medical therapy;@Bu shen qu han zhi wang decoction; Bone
destruction , Osteoclast , Experimental research , OPG/RANK/RANKL .
以补肾祛寒治尪汤良好的临床疗效及拆方的动物实验的血清学研究为基础，通过对补肾祛寒治尪汤全
方进行动物实验，探讨全方对RA骨质破坏的影响，以进一步优化本方，有利于中药的开发和推广。
1. 实验材料
1.1 实验动物 健康清洁级雄性Whistar 大鼠74只，体重130~190g，鼠龄6~8周，适应性喂养3天，由
北京市海淀区兴旺动物养殖场提供。
1.2 实验药品 甲氨喋呤片（methotrexate ,MTX）2.5mg/片：购于中日友好医院，用研钵将药品磨碎，
使用无菌蒸馏水配制为药物混悬液，按MTX 0.3mg/100g大鼠体重给药。补肾祛寒治尪汤全方制备：川断15g，
补骨脂15g，熟地黄20g，制附子9g，骨碎补18g，淫羊藿10g，白芍15g，桂枝10g，羌独活各10g，威灵仙
15g，防风10g，麻黄6g，苍术10g，知母12g，炙山甲9g，伸筋草20g，赤芍10g，松节15g，地鳖虫10g，川
牛膝12g，共含生药261g。常规煎煮，浓缩至90mL，每mL含生药2.9g，4℃储存备用。（根据人与大鼠的
体表面积换算，以60kg人体用药量的约5.8倍为大鼠等效剂量作为中剂量，以2.9倍和11.6倍分别作为大鼠小
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剂量和高剂量用量。）
1.3 主要实验试剂 10%水合氯醛、酒精、25mg牛Ⅱ型胶原蛋白（美国Chondrex公司）1支、10mL弗
氏完全佐剂（美国Chondrex 公司）2支、醋酸(Acetic acid)、抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒（产品编号387A，
美国Sigma-Aldrich公司）、抗RANKL 抗体（产品编号sc-7628）、抗OPG抗体（产品编号sc-8468，美国Santa
Cruz Biotechnology公司）、抗体稀释液（美国Dako公司）、山羊超敏二步法免疫组化检测试剂（产品编号
PV-9003，北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.4 主要实验仪器 由中日友好医院临床研究所提供，仪器：电子称（精确到1.0g），标本石蜡包埋
机，冷冻台，石蜡切片机，电烤箱，冰箱，光学显微镜（日本OlymPus公司），DP70 数码成像系统（日
本OlymPus 公司）等；工具：2mL、2.5mL和5mL灭菌注射器，研钵，骨钳，手术剪，小镊子，手术刀，
载玻片和盖玻片等。
2. 实验方法
2.1 动物分组 随机分为6组：正常对照组（简称正常组）10只、胶原诱导关节炎模型组（简称模型组）
12只、甲氨喋呤治疗组（简称MTX 组）12只、补肾祛寒治尪汤小剂量治疗组（简称小剂量组）12只，补
肾祛寒治尪汤中剂量治疗组（简称中剂量组）14只，补肾祛寒治尪汤高剂量治疗组（简称高剂量组）14只。
实验中均分笼饲养，每笼4只，自由摄食，人工自然光照，并定期清洁、消毒。
2.2 造模方法 于实验前一天牛Ⅱ型胶原蛋白溶于0.1mol/L醋酸中，2mg/mL的比例与弗氏完全佐剂1:1
充分混合乳化。除正常组外，按200ugⅡ型胶原/只大鼠的剂量，模型组和各治疗组每只大鼠尾根部1~2cm
皮下注射抗原0.2mL；7天后，模型组和各治疗组每只大鼠以100μgⅡ型胶原/只大鼠的剂量，尾根部1~2cm
皮下注射0.1mL加强免疫。
2.3 给药方法及标本采集 于加强免疫（实验开始第7天）当天开始给药。消毒饮用水由中日友好医院
临床研究所动物房提供。正常组：每天用消毒饮用水10mL/kg体重的容积灌胃，每日一次，连续28天。模
型组：每天用消毒饮用水10mL/kg体重的容积灌胃，每日一次，连续28天。MTX组：甲氨喋呤混悬液10mL/kg
体重的容积灌胃，每日一次，连续28天，相当于人体用量的5.8倍。小剂量组：补肾祛寒治尪汤全方水煎液
按10mL/kg体重的容积灌胃，每日一次，连续28天，相当于人体用量的2.9倍。中剂量组：补肾祛寒治尪汤
全方水煎液按10mL/kg体重的容积灌胃，每日一次，连续28天，相当于人体用量的5.8倍。高剂量组：补肾
祛寒治尪汤全方水煎液按10mL/kg体重的容积灌胃，每日一次，连续28天，相当于人体用量的11.6倍。标
本采集，脱钙和石蜡块包埋：末次给药24h后，用10%水合氯醛予腹腔内注射麻醉，将动物固定于手术台上，
取左侧膝关节，剔除多余皮毛、肌肉、筋膜等，保留完整的膝关节和滑膜组织于4%多聚甲醛固定液中固定
约1周。然后转入脱钙液（10%甲醛+EDTA超饱和溶液）脱钙8~12周，每1~2周更换脱钙液1次。脱钙完成
后标本依次用梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡块包埋备用。
3. 观测指标
3.1 一般观察项目 1）体重（g）：用药干预后每3天用电子称测各组动物体重。2）一般状况：大鼠
形体、毛色、反应、活动情况、食欲、大小便。
3.2 病理检测
切片制作：切片前在载玻片上涂布蛋白甘油以增强其粘附性能。将石蜡包埋的标本切成4μm厚，于温
水（约42℃）中展平后，捞至载玻片上铺正，用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入60℃温箱烤片24h。
3.2.1 HE染色 1）脱蜡：石蜡切片在烤箱烤干后，浸入（脱蜡专用）二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各15min；2）
水化：依次过梯度酒精：100%Ⅰ→100%Ⅱ→95%Ⅰ→95%Ⅱ→90%→80%→70%
→60%→50%；清水冲洗3 次，流水冲5min；3）染色：切片浸入苏木精溶液染色15min→流水漂洗
5min→0.5%盐酸乙醇分化30s→流水冲洗15min→伊红液复染10min→清水冲洗3次；4）脱水：依次过梯度
酒精：50%→60%→70%→80%→90%→__________100%Ⅰ→100%Ⅱ；5）透明、封固：切片浸入（HE透明专用）二
甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各10min；载玻片上滴加封片胶1滴，加盖玻片封固。6）待切片完全干燥后在光学显微
镜下观察形态，并用DP70数码成像系统拍照。将得到的图像采用表1的评分标准[1]进行分析。
表1 HE普通病理检测项目及评分标准
检测项目 评分标准
0分 滑膜细胞扁平，排列<3层
1分 滑膜细胞肿胀，排列3~4层
（1）滑膜细胞增生
2分 滑膜细胞肿胀，排列5~6层
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检测项目 评分标准
3分 滑膜细胞肿胀，排列>6层
0分 无炎性细胞侵润
1分 炎性细胞散在分布
2分 炎性细胞弥漫分布
（2）炎性细胞浸润
3分 存在淋巴滤泡或生发中心
0分 无新生血管
1分 滑膜轻度新生血管生成，面积<滑膜总面积的1/3
2分 滑膜中度新生血管生成，面积为滑膜总面积的1/3~2/3
（3）新生血管（血管翳）
3分 滑膜重度度新生血管生成，面积>滑膜总面积的2/3
0分 无缺损
1分 局灶性缺损
2分 缺损面积为关节软骨面总面积的1/3~ 2/3
(4)关节软骨破坏
3分 缺损面积>关节软骨面总面积的2/3
3.2.2 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色 抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase，
TRAP）是破骨细胞的特征性标记酶，故TRAP染色通常用于显示破骨细胞的数量、体积和功能状态。1）
准备500mL去离子水，预热至37℃，使用之前确认温度；2）配制修复液：柠檬酸溶液25mL，丙酮65mL 和
37%甲醛8mL，置于磨口玻璃瓶中，将盖子拧紧；3）将修复液保持在室温（18~26℃），将切片浸泡在修
复液中30s进行修复，之后用去离子水完全冲洗切片，注意切勿使切片干燥；4）在试管中加入4mL Fast Garnet
GBC Base Solution和4mL亚硝酸钠溶液，反复倒置30s混匀，然后静置2min；5）将1个500mL烧杯加入下列
试剂，混合，配制孵育液：去离子水（37℃）360mL、步骤5）产物8mL、萘酚AS-BI 磷酸盐溶液4mL、醋
酸盐溶液16mL、酒石酸盐溶液8mL。6）将孵育液从烧杯倒入染缸，在加入切片前用水浴将染缸中的溶液
加温到37℃；7）加入切片，避光，在37℃水浴下孵育1h；8）1h后用去离子水冲洗，然后用苏木素复染40s；
9）置于碱性水中5min以将细胞核染成蓝色；10）使用去离子水封片，并立即在OlymPus光学显微镜下观察，
每张切片在40倍物镜下随机选取5个视野，用DP70数码成像系统进行图像采集，然后对这些视野中的TRAP
标记（+）的细胞进行计数，并计算算术平均值。
3.2.3 RANKL 及OPG 的免疫组化染色 对核因子κB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear
factor-κB ligand，RANKL）和骨保护素（OsteoProtegerin，OPG）进行免疫组化染色。先根据说明书要求
和预试验情况将一抗用抗体稀释液进行稀释，以达到最佳效果。一抗浓度分别为：OPG 1/200，RANKL
1/400。免疫组化染色操作基本过程如下：1）脱蜡：石蜡切片在烤箱烤干后，浸入（脱蜡专用）二甲苯Ⅰ
和二甲苯Ⅱ 各15min ； 2 ） 水化： 依次过梯度酒精：
100%Ⅰ→100%Ⅱ→95%Ⅰ→95%Ⅱ→90%→80%→70%→60%→50%；清水冲洗3 次，然后流水冲5min；3）
氧化：0.2% H2O2氧化15min；4）清水冲洗3次，然后流水冲洗5min；5）0.01M PBS 液洗3次，每次5min；
6）用滤纸吸去多余水分，在切片上滴加一抗，使之完全浸没标本为宜；7）冰箱4℃条件下在湿盒中孵育
过夜，使一抗与抗原充分结合；8）0.01M PBS 液洗3 次，每次5min；9）用滤纸吸去多余水分，在切片上
滴加试剂1（Ploymer HelPer，即用型），在湿盒中孵育1~3h，此次孵育完成后0.01M PBS液洗3次，每次5min；
10）滴加试剂2（二抗，Poly-HRP anti-Goat IgG，即用型），在湿盒中继续孵育1~3h；11）0.01M PBS液洗
3次，每次5min；12）DAB 溶液染色（DAB溶液由中日友好医院临床研究所中心实验室配制，少量DAB
染料粉溶于200mL清水中制成混悬液，现用现配），染色时间OPG为8min，RANKL为3min；13）流水冲
洗2~3min，Mayer 苏木素染料复染1min（着染细胞核）；14）常规流水冲洗10min、脱水、透明、封片、
拍照，同HE染色4）~6）。将得到的图像采用表2进行分析。
表2 免疫组化病理学半定量评分标准[2]
检测项目 评分标准
（1）阳性着色程度 0分 无着色，与背景色一致
1分 浅黄色，略高于背景色
2分 棕黄色，明显高于背景色
3分 棕褐色
（2）阳性细胞所占比例 0分 阴性
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1分 25％以下
2分 25％~50％
3分 5l％一75％
4分 75％以上
两者乘积判定阳性结果，RANKL 和OPG的阳性细胞为胞浆或胞核呈棕黄色或棕褐色。
4 统计学分析
采用excel软件输入、保存资料，SPSS17.0软件进行数据资料的统计分析。计量资料均采用均数±标准
差表示。计量资料的组间比较采用重复计量资料的方差分析，组内比较采用q检验、q’检验或LSD-t检验；
病理学半定量资料的比较采用Mann-Whitney秩和检验进行两两比较。所有统计分析均为双侧检验。
5 实验结果
5.1 各组大鼠一般状态的变化情况 在造模过程中，第二次免疫即加强免疫后（实验第7d开始），除
正常组外，各造模组的大鼠双后肢开始逐渐出现红肿；至加强免疫后第3天（实验第10d），各造模组的大
鼠双后肢都出现明显的发红肿胀，大部分都肿至膝关节甚至双前肢关节处亦有红肿，提示造模成功。与正
常组相比，各造模组大鼠表现为：行动迟缓跋行，食欲减退，体重较前明显开始减轻，活动量明显减少，
毛色欠光泽。（见附录图2）
经西药MTX和中药治疗28天后，正常组:形体正常，反应敏捷，行动迅速，被毛浓密有光泽，紧贴身
体，眼睛明亮活泼，食欲良好，体重稳步增长；模型组:形体瘦弱，反应迟钝，行动缓慢跋行，被毛稀疏、
光泽度查，食欲减退，体重增加少。MTX组：形体和被毛情况较模型组好，反应灵敏度可，关节肿胀的程
度与模型组相比较无改善，行动迟缓跛行，食欲尚可，体重较模型组有增加、增加速度平稳；小剂量组：
形体和被毛情况较模型组好，反应尚可，关节肿胀程度较模型组有改善，行动迟缓、有跛行，食欲可，体
重增加平稳；中剂量组：形体和被毛情况较模型组好，反应灵敏度尚可，关节肿胀程度较模型组有改善，
行动迟缓、无跛行，食欲可，体重增加情况在各造模组表现最好，稳步增长；高剂量组：形体瘦弱，被毛
稀疏、光泽度差，反应较为迟钝，食欲减退明显，体重增加情况、关节肿胀情况与模型组相比较都无改善，
行动迟缓跛行。见表3。
表3 中药治疗28天后各组大鼠的一般情况
组别 只数 形体 毛色 反应 行动 食欲 大小便
正常组 9 丰满 浓密有光泽 敏捷 迅速 良好 正常
模型组 12 消瘦 被毛稀疏、光泽度差迟钝 缓慢跛行 明显减退 偶有腹泻
MTX 组 12 较瘦 被毛较稀疏 尚可 缓慢跛行 食欲稍差 正常
小剂量组 8 较瘦 被毛较稀疏 尚可 缓慢跛行 食欲稍差 正常
中剂量组 9 尚可 被毛略稀 尚可 迟缓、无跛行 食欲尚可 正常
高剂量组 8 较瘦 被毛稀疏、光泽度差较为迟钝缓慢跛行 明显减退 偶有腹泻
5.2 各组大鼠体重变化情况
5.2.1 纵观整个实验过程（0~35d），统计6组大鼠整个实验过程中各次体重的测量数据，经检测各组
大鼠及整体的体重数据均符合正态分布，且检验不符合球形对称条件，故采用重复计量资料的多元方差分
析，结果显示各组大鼠的体重均随时间(t)而变化，有显著统计学意义（P<0.01）；而处理因素与时间交互
作用的P值>0.05，说明处理因素与时间因素无交互作用，即正常组、各治疗组和对照组体重的时间变化没
有差异，这从各组大鼠体重随时间变化的趋势图也可以看出（见图2）。
5.2.2 纵观用药治疗的实验过程（7~35d）,采用重复计量资料的多元方差分析，结果同5.2.1中整个实验
过程得出的结论。
5.2.3 采用单因素方差分析和LSD-t或q或q’检验进行各组之间体重的比较，分别分析挑选出的7个时间
点（0,7,14,17,20,24,35d）的各组大鼠之间体重的差异情况，结果显示：1）实验开始即第1次免疫当天（0d），
各组大鼠之间体重无统计学差异（P>0.05）；2）第2次免疫即加强免疫的当天（7d），各组大鼠之间体重
无统计学差异（P>0.05），也说明第1次免疫后CIA大鼠模型尚未明确显示；3）加强免疫后第7天（14d），
各组大鼠之间体重无统计学差异（P=0.065>0.05）；4）加强免疫后第10天、第13天、第17天和实验结束当
天（17d、20d、24d、35d），各组大鼠之间的体重存在显著统计学差异（P<0.01），说明CIA大鼠的造模
是成功的；
5.2.4 在用药干预的28天的过程中（7d~35d）：1）用药干预的第1天（7d），各组大鼠之间体重无统
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计学差异（P>0.05）；2）用药干预的第7天（14d），正常组与其他各造模组大鼠的体重相比，体重有增
加，但各组之间无统计学差异（P>0.05）；3）用药干预的第10天（17d），各造模组大鼠体重均小于正常
组，中剂量组和正常组之间无统计学差异（P>0.05），而其他各造模组大鼠与正常组相比，有统计学差异
(P<0.05)，且其他各造模组之间：MTX组和小剂量组体重增加值大于模型组，高剂量组体重增加值稍小于
模型组，但各组之间无统计学差异（P>0.05）；4）用药干预的第13天、第17天和第28天（20d、24d、35d），
各造模组大鼠体重均小于正常组，中剂量组和正常组之间无统计学差异（P>0.05），其他各造模组大鼠与
正常组相比有显著统计学差异(P<0.01)，而其他各造模组之间：MTX组和小剂量组体重增加值大于模型组，
高剂量组体重增加值与模型组相似，但各组之间无统计学差异（P>0.05）。见表4（2），图1。
表4（1）
组别 0d 7d 14d 17d 20d 24d 35d
正常组 190.30±18.43 271.80±22.68 287.67±31.00 309.44±36.47 325.44±42.79 341.00±45.97 406.78±49.84
模型组 192.92±20.21 255.33±26.60 263.17±38.06 267.75±42.40 270.92±48.60 279.58±54.31 327.17±67.09
MTX 组 186.33±14.85 255.08±16.73 267.75±20.03 273.67±17.76 283.08±16.55 293.92±20.66 340.25±24.78
小剂量组 191.42±17.12 263.75±20.01 258.30±29.49 270.00±32.09 284.38±38.56 295.88±43.22 339.00±38.12
中剂量组 196.93±20.05 269.07±22.19 274.50±13.13 286.70±19.70 301.90±22.06 313.40±24.17 365.89±36.53
高剂量组 189.64±18.10 264.36±21.49 249.00±22.84 252.11±27.21 263.13±27.86 268.38±28.45 314.63±34.78
表4（2）
组别 0d 7d 14d 17d 20d 24d 35d
正常组 o o o A A A A
模型组 o o o a ao ao ao
MTX 组 o o o a ao ao ao
小剂量组 o o o a ao ao ao
中剂量组 o o o A A A A
高剂量组 o o o a ao ao ao
P<0.05 P<0.01 P<0.01 P<0.01
注：O表示无统计学差异，同一字母的大写字母（如A）优于小写字母（如a）并且具有统计学意义。
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
400.00
450.00
0d 7d 14d 17d 20d 24d 35d
大鼠体重（单位g）
测量时间（单位d）
各组大鼠体重随时间变化趋势
正常组
模型组
MTX组
小剂量中药组
中剂量中药组
高剂量中药组
图2
5.2.5 将各组大鼠实验和治疗前后的体重变化值进行比较，经检验均符合正态分布，进行单因素方差
分析，各造模组大鼠体重的增值均小于正常组，中剂量组和正常组之间无统计学差异（P>0.05），其他各
造模组大鼠与正常组相比有统计学差异(P<0.05)，而其他各造模组之间：MTX 组和小剂量组体重增加值大
于模型组，高剂量组体重增加值与模型组相似，但各组之间无统计学差异（P>0.05）。见表5、图3（1）、
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图3（2）。
表5 大鼠实验和治疗前后的体重变化情况（单位g）
体重g 分组 正常组 模型组 MTX 组 小剂量组 中剂量组 高剂量组
实验前后 219.11±
55.02
134.25±
70.57
153.92±
32.06
149.63±
44.19
174.11±
53.95
122.25±
40.43
治疗前后 138.44±
51.67
71.83±
73.07
85.17±
32.31 79.88±40.01 101.56±
55.40
48.00±
41.93
216.48
134.25
153.92 147.58
168.96
124.98
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
400.00
450.00
正常组模型组MTX组小剂量中药组中剂量中药组高剂量中药组
大鼠实验前后体重变化
体重变化（单位g）
实验初始体重（单位g）
图3（1）
134.98
71.83
85.17 75.25
96.82
50.27
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
400.00
450.00
正常组模型组MTX组小剂量中药组中剂量中药组高剂量中药组
大鼠治疗前后体重变化
体重变化(单位g)
治疗前体重（7d，单位g）
图3（2）
5.3 中药干预对各组大鼠关节普通病理的影响（HE 染色）
5.3.1 显微镜下观察
5.3.1.1 整体的镜下观察 正常组的大鼠关节结构完整，关节软骨面光滑完整，色泽正常，软骨细胞形
态正常，无肿胀、坏死等，关节间隙正常存在；滑膜无肿胀，细胞扁平，单层规则排列，无增生；无或仅
见少量炎性细胞浸润；未见血管翳增生。（见图3A及附录图3）模型组大鼠关节结构有破坏，以关节面的
软骨破坏为主，大量软骨细胞肿胀、坏死，部分可见骨小梁侵蚀、破坏，关节腔间隙明显变窄；滑膜肿胀、
增厚，细胞分布不规则，呈多层排列，多见滑膜形成关节腔中绒毛结节样突起；关节腔可见大量炎性细胞
浸润；部分滑膜中可见新生血管翳。（见图3B及附录图3）
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·219·
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Experimental study
A 正常组（HE×40） 正常组（HE×100）
B 模型组（HE×100） 图4 整体的镜下观察（HE 染色）
5.3.1.2 各组镜下观察 1)正常组：大鼠关节软骨面光滑完整，色泽正常，软骨细胞形态正常，无肿胀、
坏死等，关节间隙正常存在；滑膜无肿胀，细胞扁平，单层规则排列，无增生；无或仅见少量炎性细胞浸
润；未见血管翳增生，见图5（A）。2)模型组：大鼠关节软骨面存在明显的破坏，大量软骨细胞肿胀、坏
死（核固缩深染等表现），关节腔间隙明显变窄；滑膜肿胀、增厚，细胞分布不规则，呈多层排列，多见
滑膜形成关节腔中绒毛结节样突起；关节腔可见大量炎性细胞（淋巴细胞、巨噬细胞及嗜酸性粒细胞等）
浸润；部分滑膜中可见新生血管翳，见图5（B）。3）MTX组：大鼠关节软骨面存在破坏，有软骨细胞肿
胀、坏死，软骨坏死面积较模型组有减小，余滑膜增生、炎性细胞侵润、新生血管翳均较模型组无改善，
见图5（C）。4）小剂量组：大鼠关节软骨面存在破坏，有软骨细胞肿胀、坏死，软骨坏死面积较模型组
有减小；滑膜肿胀、增厚，细胞分布不规则，呈多层排列，可见滑膜形成关节腔中绒毛结节样突起，但整
体增生的滑膜面积较模型组减小；新生血管翳较模型组有减少；炎性细胞侵润较模型组无改善，见图5（D）。
5）中剂量组：大鼠关节软骨面存在破坏，有软骨细胞肿胀、坏死，软骨坏死面积较模型组明显减小；滑
膜肿胀、增厚，细胞分布不规则，呈多层排列，可见滑膜形成关节腔中绒毛结节样突起，但整体增生的滑
膜面积较模型组明显减小；部分炎性细胞侵润；新生血管翳情况较模型组有改善，见图5（E）。6）高剂
量组：大鼠关节软骨面存在破坏，有软骨细胞肿胀、坏死，软骨坏死面积较模型组有减小；滑膜肿胀、增
厚，细胞分布不规则，呈多层排列，可见滑膜形成关节腔中绒毛结节样突起，但整体增生的滑膜面积较模
型组减小；新生血管翳较模型组减少；炎性细胞侵润情况较模型组无改善，见图5（F）。
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（A） （B）
（C） （D）
（E） （F）
图5 各组膝关节横截面病理形态（HE×200）
5.3.2 HE染色病理评分结果 1) 在滑膜细胞增生方面，只有模型组与正常组比较，滑膜细胞增生较明
显，有显著差异(P<0.01)；而其余各组间差异均没有统计学意义(P>0.05)。2）在炎性细胞浸润方面，统计
结果同1）滑膜细胞增生。3）在新生血管翳方面，各造模组与正常组相比较，存在新生血管翳，有显著差
异(P<0.01)；模型组与各用药组相比较：MTX组与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05)，小剂量组与模
型组之间差异有统计学意义（P<0.05），中、高剂量组与模型组之间差异有显著统计学意义（P<0.01）。4）
在软骨破坏方面，各造模组与正常组相比较，都存在不同程度的软骨破坏，有显著差异(P<0.01)；模型组
与各用药组相比：MTX组与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05)，低、中、高剂量组和与模型组之间差
异有统计学意义（P<0.05）。5）在总积分（滑膜细胞增生+炎性细胞浸润+新生血管翳+软骨破坏）方面，
各造模组与正常组相比较，有显著差异(P<0.01)；模型组与各用药组相比：MTX组与模型组之间差异无统
计学意义(P>0.05)，低、中、高剂量组和与模型组之间差异有统计学意义（P<0.05），以中剂量组的P值最
小，接近0.01（P=0.012）。
以上研究结果表明:CIA大鼠的造模是成功的，并且与人类RA关节局部病理改变非常类似；用药可以改
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·221·
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善大鼠关节病理异常，主要表现在减少新生血管和关节软骨破坏方面，呈一定量效关系，以中剂量中药组
效果最为明显；在滑膜细胞增生和炎性细胞侵润方面，镜下总体观察，用药组较模型组有改善，但半定量
评分无统计学意义的差异；在用药组中MTX 组和小剂量组反应较差。
表6 各组大鼠普通病理（HE染色）的积分
组别 只数 滑膜细胞增生 炎性细胞浸润 新生血管 关节软骨破坏 总积分
正常组 8 0.13±0.35 0.13±0.35 0.00±0.00 0.00±0.00 0.25±0.46
模型组 8 2.63±0.74** 0.92±0.35** 1.75±0.46** 2.50±0.93** 8.75±2.19**
MTX 组 8 2.88±0.35** 1.75±0.46** 1.38±0.52** 1.63±0.74** 7.63±1.41**
小剂量组 8 2.88±0.35** 1.75±0.46** 1.13±0.35** 1.13±0.35** 6.88±1.13**
中剂量组 8 2.38±0.74** 1.50±0.53** 0.75±0.46** 1.13±0.64** 5.75±1.98**
大剂量组 8 2.88±0.35** 1.63±0.52** 0.88±0.35** 1．25±0.46** 6.63±1.30**
注：频数资料，采用秩和检验进行组间比较。与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，P<0.05，
P<0.01。
5.4 TRAP 染色破骨细胞计数结果
TRAP是破骨细胞的特征性酶，破骨细胞在TRAP染色下胞浆红染，即TRAP（＋），胞核可以是1个或
多个。
5.4.1 光镜下可见 1）正常组仅在关节面软骨与骨小梁交界处见到少量TRAP（＋）细胞，通常是单
个出现，见图（A）；2）模型组在关节面软骨、骺板软骨与骨小梁交界处均可见到成群甚至大量分布的TRAP
（＋）细胞，大小不一，其中可见多个多核细胞（见附录图6（B））；3）MTX组主要在关节面软骨与骨
小梁交界处可见成群TRAP （＋）__________细胞，其中有巨型多核细胞，体积明显大于在正常组观察到的同类细胞，
见图6（C）；4）小剂量组主要在关节面软骨与骨小梁交界处可见成群TRAP（＋）细胞，大小不一，见图
6（D）；5）中剂量组主要在骨小梁的骨陷凹中可见部分成群TRAP （＋）细胞，大小不一，见图6（E）；
6）大剂量组主要在关节面软骨与骨小梁交界处可见成群分布的TRAP（＋）细胞，大小不一，其中有巨型
多核细胞，见图6（F）。
（A） （B）
（C） （D）
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（E） （F）
图6 TRAP染色计数破骨细胞（×400）
5.4.2 通过TRAP（＋）的破骨细胞细胞计数（见表7） 1）与正常组相比，各造模组破骨细胞数均有
增多，其中：中剂量组、高剂量组与正常组无统计学意义上的差异（P>0.05）；其他各造模组（模型组、
MTX组、小剂量组）与正常组比较TRAP（＋）细胞数量均明显增多（P<0.01）；2）与模型组相比：中剂
量组、高剂量组的TRAP（＋）细胞数量均明显减少（P<0.01）；MTX组、小剂量组与模型组无统计学差
异（P>0.05）。
表7 各组大鼠TRAP （＋）细胞计数比较
组别 只数 TRAP （+）细胞计数（个/HP）
正常组 8 5.00±2.65
模型组 8 8.90±3.60**
MTX 组 8 6.70±2.85**
小剂量组 8 6.90±3.26**
中剂量组 8 5.10±2.65
高剂量组 8 5.50±3.06
注：频数资料，采用秩和检验进行组间比较。与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，P<0.05，
P<0.01。
5.5 RANKL和OPG免疫组化染色
5.5.1 显微镜下观察 见附录图4。1）在光镜下观察RANKL和OPG的免疫组化切片，染色（＋）部分
呈现黄色至棕褐色。RANKL 和OPG 在关节面软骨细胞、骨细胞、成骨细胞和骺板软骨细胞的胞浆中都
有表达，以关节面软骨细胞的阳性表达最为明显。2）RANKL和OPG在各造模组关节软骨/软骨下骨/骨小
梁区的表达均高于正常组。正常组的关节软骨/软骨下骨/骨小梁区有部分软骨细胞、骨细胞的胞浆中呈现
浅黄褐染色，细胞形态正常、呈圆形；各造模组的关节软骨/软骨下骨/骨小梁区则可见成片的RANKL和OPG
（＋）细胞，胞浆呈棕褐色。
5.5.2 免疫组化染色病理评分结果 见表8（1）。
1）RANKL 和OPG 这2个指标，各组之间阳性细胞所占比例、阳性细胞着色程度、总积分（阳性细
胞所占比例×阳性细胞着色程度）都存在显著的统计学差异（P<0.01或P<0.05）；
2）RANKL染色结果显示：阳性细胞所占比例情况：与正常组相比，模型组和高剂量组的阳性表达都
明显升高（P<0.01）；MTX组、小剂量组阳性表达升高（P<0.05）；中剂量组阳性表达在数值上有升高，
但无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，MTX组、中剂量组的阳性表达降低（P<0.05）；小剂量组和
高剂量组的阳性表达在数值上有降低，但无统计学意义（P>0.05）。阳性细胞着色程度：与正常组相比，
小剂量组和高剂量组的阳性表达均明显升高（P<0.01）；模型组、MTX 组的阳性表达都升高（P<0.05）；
中剂量组阳性表达在数值上有升高，但无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，各用药组的阳性表达在
数值上有降低，但无统计学意义（P>0.05）。总积分：与正常组相比，模型组、MTX组、小剂量组和高剂
量组的阳性表达都明显升高（P<0.01）；中剂量组阳性表达在数值上有升高，但无统计学意义（P>0.05）。
与模型组相比，各用药组的阳性表达在数值上有降低，但无统计学意义（P>0.05）。
3）OPG 染色结果显示：阳性细胞所占比例情况：与正常组相比，小剂量、中剂量和高剂量组的阳性
表达都明显升高（P<0.01）；模型组、MTX组的阳性表达升高（P<0.05）。与模型组相比，各用药组的阳
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性表达无统计学意义的差异（P>0.05）。
阳性细胞着色程度：与正常组相比，小剂量组的阳性表达明显升高（P<0.01）；模型组、中剂量组、
高剂量组的阳性表达都升高（P<0.05）；MTX 组阳性表达在数值上有升高，但无统计学意义（P>0.05）。
与模型组相比，各用药组的阳性表达无统计学意义的差异（P>0.05）。
总积分：与正常组相比，小剂量组、中剂量组、高剂量组的阳性表达都明显升高（P<0.01）；模型组
的阳性表达升高（P<0.05）；MTX 组阳性表达在数值上有升高，但无统计学意义（P>0.05）。与模型组
相比，各用药组的阳性表达无统计学意义的差异（P>0.05）。
4）OPG/RANKL：将各组免疫组化的总评分进行OPG/RANKL 的相除计算，可见在数值上，正常组
和MTX 组、小剂量中药组要高于模型组，但各组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表8（2）。
表8（1） 各组大鼠RANKL 和OPG（免疫组化染色）的积分
RANKL 只
数
阳性细胞所
占比例
阳性细胞着
色程度
总积分 OPG 阳性细胞所
占比例
阳性细胞着
色程度
总积分
正常 8 1.88±0.35 2.13±0.64 4.00±1.5
1 正常 1.63±0.52 2.00±0.76 3.50±2.0
0
模型 8 3.13±0.64** 2.88±0.35* 9.13±2.4
7** 模型 2.75±1.04* 2.75±0.46* 7.88±3.6
0*
MTX 8 2.38±0.52* 2.88±0.35* 6.88±1.8
9** MTX 2.25±0.71* 2.63±0.52 5.88±2.2
3
小剂量 8 2.63±0.52* 3.00±0.00
**
7.88±1.5
5
**
小剂量 2.50±0.53** 3.00±0.00*
*
7.50±1.6
0**
中剂量 8 2.38±0.74 2.50±0.53 6.13±2.9
5 中剂量 2.88±0.64** 2.75±0.46* 8.13±2.7
5**
高剂量 8 3.00±0.00** 3.00±0.00** 9.00±0.0
0** 高剂量 3.38±0.74** 2.88±0.35* 9.88±2.8
0**
表8（2） 各组大鼠OPG/RANKL 的比值
组别 只数 OPG/RANKL
正常组 8 1.03±0.90
模型组 8 0.91±0.43
MTX 组 8 0.94±0.49
小剂量组 8 1.00±0.35
中剂量组 8 1.50±0.68
高剂量组 8 1.10±0.31
注：频数资料，采用秩和检验进行组间比较。与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，P<0.05，
P<0.01。
6 结论与讨论
6.1 实验结论 将实验结果综合分析：1）补肾祛寒治尪汤治疗胶原诱导型关节炎大鼠（CIA 大鼠）时，
可以延缓CIA 大鼠膝关节的骨质破坏；考虑是通过影响OPG/RANK/RANKL 系统来抑制破骨细胞活性，
从而延缓膝关节的骨质破坏；2）常规剂量（即实验中中剂量中药组）的补肾祛寒治尪汤，在CIA 大鼠的
体重、食欲、反应、行动等整体各方面，是包括西药MTX 组在内的各用药组中从宏观到微观病情缓解最
为明显的一组，故考虑本方应用于临床可改善RA 患者整体的病情和反应情况，同时应该作用于RA 疾病
过程中多个环节、多个靶点；3）常规剂量的补肾祛寒治尪汤针对RA 骨破坏是有效果的而且无明显不良反
应，故可长期应用于临床，还可进一步完善相关的基础实验研究，并可考虑成方的研发推广和应用。
具体分析，在体重方面：与模型组比较，MTX 组、小剂量组、中剂量组均能改善大鼠的体重，中剂
量组最为明显，但大剂量组对体重改善无效。在膝关节局部的病理学方面：1）HE 染色：用药可以改善大
鼠关节病理异常，主要表现在减少新生血管和关节软骨破坏方面，呈一定量效关系，以中剂量组效果最为
明显；在滑膜细胞增生和炎性细胞侵润方面，镜下总体观察，用药组较模型组有改善，但半定量评分无统
计学意义的差异；在用药组中MTX 组和小剂量组反应较差。2）TRAP 染色破骨细胞计数：用药可以减少
破骨细胞的生成，以中剂量和高剂量组的效果最为明显，在用药组中MTX 组和小剂量组反应较差。3）
RANKL 和OPG 免疫组化染色：本实验中，RANKL 在各造模组中的表达都明显高于正常组，OPG 的表达
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也明显增高，考虑可能是TNF-α 等炎症因子刺激成骨细胞所致，属于机体的负反馈调节作用。
实验结果显示，MTX 和中药各组都可降低RANKL 的水平，中药各组呈一定的量效关系，以中剂量
组最为明显；MTX 组亦较为明显；这样即可通过OPG/RANK/RANKL 系统达到抑制破骨细胞的分化、生
成和活性的目的，进而减缓RA 的骨侵蚀。与模型组相比，各中药组对OPG 的影响不明显。
6.2 关于补肾祛寒治尪汤 焦树德先生认为“尪痹”（RA）的病因病机为素体肾虚,寒湿邪盛深侵入肾,
或先天凛赋不足或后天失养,遗精滑精,房室过度,劳累过极,产后失血,月经过多等而致肾虚,正不御邪；冬季
寒盛,感受三邪,肾气应之,寒袭入肾；其复感三邪,内舍肝肾；寒湿贼风,痰浊瘀血,互为胶结,凝聚不散。尪痹
与其他痹病不同之处主要在于为寒湿之邪深侵入肾,并影响到肝, 骨损筋挛，病情更为深重。
补肾祛寒治尪汤是焦树德先生针对“尪痹”（RA）拟定的一个基础方，此方适用于肾虚寒盛证，是根据
《金匮要略》中桂枝芍药知母汤合《和剂局方》虎骨散加减化裁而成[3]，方中：川续断、补骨脂补肾壮筋
骨，制附片补肾阳、祛寒邪，熟地黄填精补血、补养肝肾为主药；骨碎补、淫羊藿温补肾阳、强壮筋骨，
桂枝、独活、威灵仙搜散筋骨肢体风寒湿邪，白芍养血荣筋、缓急舒挛为辅药；防风散风，麻黄散寒，苍
术祛湿，赤芍化瘀清热，知母滋肾清热，山甲通经散结，地鳖虫活瘀壮骨，伸筋草舒筋活络，松节通利关
节为佐药；牛膝下行引药入肾为使药，共奏补肝肾，强筋壮骨，祛除风寒湿邪，化瘀通络之功。结合焦树
德先生对尪痹(RA)病因病机的认识，可以看出此方以补肝肾为基础，肾为重中之重，而在前文的综述中已
经讨论了“肾主骨”，肾与骨的关系密切，故从本方的立法处方用药方面都考虑到了延缓尪痹（RA）的骨质
损伤，并且在临床应用中也取得了良好的疗效，有临床个案的报道[4-6]，且导师王伟钢[7]曾以补肾祛寒治尪
汤为基础加减治疗RA患者38例，2个月为1个疗程，观察1~3个疗程，如治疗前已服用肾上腺皮质激素或非
甾体抗炎药物的患者可先维持原剂量，待开始中药治疗后，逐渐将西药减量至撤除；根据中国中医药学会
痹病专业委员会制定的疗效判定标准，结果显示：38例中临床治愈3例、显效8例、好转22例、无效5例，
愈显率28.95%，总有效率86.84%；在治疗前后的关节数方面疼痛消失为252个、改善的348个、无变化或加
重的为88个，消失和改善的占87.21%；肿胀消失165个、改善137个、无变化或加重69个，消失和改善的占
80.32%；RA 晨僵时间治疗前平均为（89.34±13.79）min，治疗后为（46.26±8.00）min，有显著的统计学
差异（P<0.01）；其他临床症状（关节喜暖怕冷、腰腿酸软、倦怠、关节功能、握力、提重力、蹬力、20
米步行时间、蹬阶时间）在治疗前后都有不同程度的改善。
在前期也已经有师兄师姐对本方进行了全方和拆方的基础实验研究，表明补肾祛寒治尪汤全方的实验
疗效最佳，能适当纠正CIA 模型大鼠的体重减轻，对关节炎症肿胀有显著抑制作用，能显著降低血清中
IL-2、TNFα水平(P<0.05)，与MTX 组显著差异，而且全方引起脾脏萎缩的程度较MTX 组轻，因此考虑补
肾祛寒治尪汤可直接或间接抑制RA关节的炎症情况和关节软骨、骨的破坏，同时副作用较MTX小；其中
补肾组和祛邪组中药都能有效改善大鼠关节局部肿胀，祛邪组中药可有效降低血清中IL-2、TNFα的水平，
且补肾+祛邪组中药能够显著减低CIA大鼠的发病峰值，推迟峰值出现时间，缓病情发展速度；活血组与模
型组相比可改善大鼠足肿胀度、降低血清中TNFα 的水平，但疗效不及补肾、祛邪等其他用药组[8]。
6.3 补肾祛寒治尪汤对RA骨侵蚀OPG/RANK/RANKL系统的调控 破骨细胞（OC）在包括RA在内的
疾病导致的骨破坏过程中处于核心地位，在骨破坏的过程中破骨细胞活化和表达增加，最终导致骨破坏。
而OPG/RANK/RANKL系统则在破骨细胞的分化激活过程中发挥重要作用，这些在前文的综述中已经有所
论述。故抑制RA 关节中RANKL的表达以及促进OPG 的表达成为防治RA关节骨质破坏的有效途径，通过
分析OPG/RANKL比值筛选相关药物也有了实际意义。本实验表明，补肾祛寒治尪汤可下调CIA大鼠膝关
节软骨组织中RANKL表达的水平，对OPG 表达的影响则不明显。
本实验的结果显示，首先，西药MTX和中药各组都能降低RANKL水平，以中剂量组和MTX组明显，
这样进而就可以减少破骨细胞的活化，延缓骨质的破坏。从中医角度分析，“肾主骨”，肾气应于冬，寒为
冬之性，故风寒湿邪侵入经络关节导致痹证（RA），故从肾论治可收良效，补肾祛寒治尪汤中川断、补骨
脂、熟地、制附片、骨碎补、淫羊藿、川牛膝等药物均有补益肝肾、强筋壮骨的功效，故可改善RA 骨质
破坏的情况。其次，关于OPG，其在各造模组中的表达也都明显高于正常组，与模型组相比，MTX组和小
剂量组的表达有降低，而中、高剂量组的OPG 表达则升高，但各组之间无统计学意义；第三，关于
OPG/RANKL比值，在正常组和各用药组都较为恒定，与模型组区别不是太明显，而各治疗组的
OPG/RANKL与模型组相比无统计学差异，故关于本方抑制CIA大鼠膝关节骨损伤的机制与影响OPG表达
是否相关，以及本方小剂量长期用药是否可促进OPG 表达尚有待研究。
由本实验结果可知，抑制关节软骨和骨组织中RANKL 的表达为补肾祛寒治尪汤抑制RA关节软骨和骨
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破坏的机制之一，值得进一步探讨，同时该方用药剂量对OPG表达的影响还可进行研究，进一步阐明补肾
祛寒治尪汤对OPG/RANK/RANKL系统的作用。
此外，本实验结果表明与模型组、中药组相比，西药甲氨喋呤（MTX）对CIA大鼠关节OPG的表达是
有抑制作用的，故关于MTX对RA 骨破坏产生治疗作用也可能是通过OPG/RANK/RANKL系统产生作用
的，也可进一步进行文献资料的搜集、分析和实验研究。
6.4 对本实验过程中一些问题的思考和分析
6.4.1 此次实验我们选用了甲氨喋呤(MTX)作为西药对照组，而且剂量选择了临床实践中人体应用偏高
的剂量30mg/w。MTX 作为目前DMARDs中的“基石”药物，这在2010年美国风湿病学会和欧洲风湿病学会
联合制定的新的关于RA指南中也有提到，是DAMARs中被首先推荐应用于RA 临床治疗的，其同时作用于
RA 炎症和骨质破坏的过程；而且，在大量的临床和基础实验中，MTX都是被用作标准对照药物，也有着
良好的效果。但在此次实验，作为西药对照组的MTX组大鼠在整个实验过程中反应并不好，最主要表现在
肉眼观察MTX组大鼠的关节肿胀程度与模型组相差无几，而且后来镜下观察也发现MTX组大鼠的膝关节
有大量炎细胞侵润、滑膜增生和部分软骨破坏。这与其他很多临床和基础实验的情况并不相符。曾查阅部
分文献，也提到MTX在临床的疗效个体差异较大，近几年有提出因为遗传基因的差异，导致部分人的机体
对MTX不敏感。但这种情况在一般的基础实验中并没有出现，而且MTX组虽然膝关节红肿明显、行动不
便，但与模型组和其他中药组比较，其食欲和精神尚可，并没有出现在有些研究中提到的MTX剂量偏大就
有可能出现胃肠道、造血系统等不良反应。综合考虑，我们大胆推测，此次实验中MTX疗效差最有可能的
原因为药物质量问题，药物的有效成分不足，需要在以后的实验中多加注意。
6.4.2 在此次实验过程中，设立了3个剂量的中药组：小剂量、中剂量和高剂量组。在实验整个过程中
实验动物的一般状态、体重以及膝关节的病理学检查结果显示，高剂量中药组（补肾祛寒治尪汤）的反应
都不是很好，死亡数量也最多。尤其是在给大鼠灌胃的过程中，虽然有很大一部分因素是因为我们自身灌
胃技术不熟练，导致在用药前期中药各组的大鼠因灌胃有不同程度的死亡，但高剂量中药组的大鼠在除却
我们自身灌胃问题外，与其他各剂量中药组及MTX 组相比，在一般状态（尤其是食欲方面）、体重、膝
踝关节肿胀情况方面都与模型组相差无几，甚至更差。故考虑本方（补肾祛寒治尪汤）在剂量过大时，可
能存在不良反应，尤其是胃肠道的不良反应，导致大鼠食欲差、体重增长缓慢而且药物吸收不良。出于这
方面的考虑，本人进行了关于中药不良反应和毒性，以及组成本方的21味中药可能存在的不良反应和毒性，
这两方面的文献检索。具体到本次实验所用的补肾祛寒治尪汤，共有21味中药，兼顾补肾强筋骨、祛邪、
活血、健脾利湿之功效。在这21味中药中，常见的容易产生不良反应甚至毒性的药物有：制附片、补骨脂、
白芍、威灵仙、麻黄、地鳖虫。而这几种中药常见的不良反应主要涉及循环系统、神经系统、消化系统（包
括胃肠道不良反应和肝功能）、泌尿系统（包括肾功能）、皮肤等至全身的过敏反应等。这几种中药本身
亦含有一些典型的可引起不良反应甚至毒性的中药成分，如乌头碱、补骨脂酚、疑似马兜铃酸成分、白芍
总苷、麻黄素，等等；且部分与药物剂量的大小，药物煎煮的时间有很密切的关系。所以，在此次实验中，
高剂量中药组的大鼠反应不好不能排除是因中药不良反应导致的。至于是何种中药及成分，到何种剂量和
用药时间时大鼠便不能再耐受，则需要更进一步的研究和探索，可以进行文献检索收集后定量统计分析的
理论研究，而且补肾祛寒治尪汤为一个整方，各种药物及成分之间通过配伍和相互作用也会产生增效、减
毒等方面的作用，故可以考虑以全方、部分拆方等方式来进行本方不良反应甚至毒性的研究。这对本方将
来的开发、利用和推广也是必不可少的。
6.4.3 在查阅文献的过程中，了解到了在RA 导致关节破坏最终残疾的过程中，关节软骨和软骨细胞损
伤也是很重要的一个过程，而且近几年已经有一些研究涉及该方面。而在此次实验过程中，我们也发现在
35天实验的周期中大鼠关节面软骨的损伤和一些抗体的表达都是比较明显的，故可以考虑探索补肾祛寒治
尪汤对关节软骨的影响。
6.4.4 此次实验已经表明补肾祛寒治尪汤全方通过OPG/RANK/RANKL系统的作用对破骨细胞有抑制
作用，而且主要是对RANKL产生影响，进而延缓RA骨质破坏；而近年来研究发现关于RANKL对破骨细胞
的激活分化等过程则主要是通过4条信号转导通路实现的：如首先 RANKL与RANK结合，激活肿瘤坏死因
子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor6，TRAF6)，再刺激Tc1细胞核因子(nuclear factor of activated
T cellsc1，NFATc1)，进而达到OC的分化和激活；其次，RANKL激活c-Fos/AP-1，通过这二者再刺激NFATc1
以分化OC等等[9-10]。故可以考虑进一步探究补肾祛寒治尪汤对RANKL信号通路的影响。
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Experimental study
参考文献
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(中日友好医院国际医疗部一病区,100029)
摘要 目的：评价补肾祛寒治尪汤全方对胶原诱导型关节炎模型（CIA）大鼠骨质破坏的影响及机制。方
法：将大鼠随机分为6 组：正常组、模型组、甲氨喋呤（MTX）组，补肾祛寒治尪汤全方小剂量组、中剂
量组和高剂量组。各用药组给药28 天，观察各组大鼠的一般情况，体重变化，制作大鼠膝关节病理切片
（HE 染色，TRAP 染色计数破骨细胞和OPG/RANKL 免疫组化染色），并在光镜下观察其形态同时进行
半定量分析。结果：1）较模型组，全方中、小剂量组及MTX 组均能改善大鼠的一般情况和体重变化情况，
中剂量组效果最佳。2）HE 染色：较模型组，用药可以改善大鼠关节病理异常，主要表现在减少新生血管
和关节软骨破坏方面，中剂量组效果最明显（P<0.01）。3）TRAP 染色：较模型组，中、高剂量组的TRAP
（＋）细胞数量均明显减少（P<0.01）。4）RANKL 免疫组化：模型、MTX、小剂量和高剂量组的阳性表
达都较正常组明显升高（P<0.01）；中剂量组阳性表达在数值上有升高；各用药组的阳性表达都较模型组
在数值上有降低。结论：1）补肾祛寒治尪汤可延缓CIA 大鼠膝关节的骨质破坏；考虑是通过影响
OPG/RANK/RANKL 系统来抑制破骨细胞活性。2）中剂量中药组效果最佳。
关键词 类风湿关节炎/ 中医药疗法；@补肾祛寒治尪汤； 骨破坏； 破骨细胞； 实验研究；
OPG/RANK/RANKL。
Abstract Objective: To evaluate the effect of “ Bu shen qu han zhi wang” decoction on bone destruction of CIA
rats, and to investigate the possible mechanism. Methods : Groups of rats with Collagen Ⅱ-induced Arthritis(CIA)
were treated with methotrexate, low-dose , usual-dose and high-dose herbal medicine from day 7 to the end of
experiment(day 35) . The nomal rats and CIA rats without medicine intervention as the control groups .To
obeserve the symptoms and weight rats, and the left knee were then removed for histopathology , including HE
staining , TRAP staining for OC(osteoclast) and Immunohistochemical staining of OPG/RANKL. Besides, to
evaluate semi-quantitative analysis for the histopathological slides. Results :Compared with the model group ,
MTX and different doses herbal medicine groups have effects on the symptoms , changes of weights and
histopathologically qualitative and quantitative analyses of CIA rats . There is a certain dose-effect relationship ,
in which the usual-dose herbal medicine group has the best effect , compared with other groups of CIA rats.
Conclusions :The usual-dose “ Bu shen qu han zhi wang ” decoction can improve symptoms and postpone the
bone destruction of CIA rats . We suggest that the possible mechanism of this progress could be a suppression of
osteoclasts through OPG/RANK/RANKL .
Key words Rheumatoid arthritis/Chinese medical therapy;@Bu shen qu han zhi wang decoction; Bone
destruction , Osteoclast , Experimental research , OPG/RANK/RANKL .
以补肾祛寒治尪汤良好的临床疗效及拆方的动物实验的血清学研究为基础，通过对补肾祛寒治尪汤全
方进行动物实验，探讨全方对RA骨质破坏的影响，以进一步优化本方，有利于中药的开发和推广。
1. 实验材料
1.1 实验动物 健康清洁级雄性Whistar 大鼠74只，体重130~190g，鼠龄6~8周，适应性喂养3天，由
北京市海淀区兴旺动物养殖场提供。
1.2 实验药品 甲氨喋呤片（methotrexate ,MTX）2.5mg/片：购于中日友好医院，用研钵将药品磨碎，
使用无菌蒸馏水配制为药物混悬液，按MTX 0.3mg/100g大鼠体重给药。补肾祛寒治尪汤全方制备：川断15g，
补骨脂15g，熟地黄20g，制附子9g，骨碎补18g，淫羊藿10g，白芍15g，桂枝10g，羌独活各10g，威灵仙
15g，防风10g，麻黄6g，苍术10g，知母12g，炙山甲9g，伸筋草20g，赤芍10g，松节15g，地鳖虫10g，川
牛膝12g，共含生药261g。常规煎煮，浓缩至90mL，每mL含生药2.9g，4℃储存备用。（根据人与大鼠的
体表面积换算，以60kg人体用药量的约5.8倍为大鼠等效剂量作为中剂量，以2.9倍和11.6倍分别作为大鼠小
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剂量和高剂量用量。）
1.3 主要实验试剂 10%水合氯醛、酒精、25mg牛Ⅱ型胶原蛋白（美国Chondrex公司）1支、10mL弗
氏完全佐剂（美国Chondrex 公司）2支、醋酸(Acetic acid)、抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒（产品编号387A，
美国Sigma-Aldrich公司）、抗RANKL 抗体（产品编号sc-7628）、抗OPG抗体（产品编号sc-8468，美国Santa
Cruz Biotechnology公司）、抗体稀释液（美国Dako公司）、山羊超敏二步法免疫组化检测试剂（产品编号
PV-9003，北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.4 主要实验仪器 由中日友好医院临床研究所提供，仪器：电子称（精确到1.0g），标本石蜡包埋
机，冷冻台，石蜡切片机，电烤箱，冰箱，光学显微镜（日本OlymPus公司），DP70 数码成像系统（日
本OlymPus 公司）等；工具：2mL、2.5mL和5mL灭菌注射器，研钵，骨钳，手术剪，小镊子，手术刀，
载玻片和盖玻片等。
2. 实验方法
2.1 动物分组 随机分为6组：正常对照组（简称正常组）10只、胶原诱导关节炎模型组（简称模型组）
12只、甲氨喋呤治疗组（简称MTX 组）12只、补肾祛寒治尪汤小剂量治疗组（简称小剂量组）12只，补
肾祛寒治尪汤中剂量治疗组（简称中剂量组）14只，补肾祛寒治尪汤高剂量治疗组（简称高剂量组）14只。
实验中均分笼饲养，每笼4只，自由摄食，人工自然光照，并定期清洁、消毒。
2.2 造模方法 于实验前一天牛Ⅱ型胶原蛋白溶于0.1mol/L醋酸中，2mg/mL的比例与弗氏完全佐剂1:1
充分混合乳化。除正常组外，按200ugⅡ型胶原/只大鼠的剂量，模型组和各治疗组每只大鼠尾根部1~2cm
皮下注射抗原0.2mL；7天后，模型组和各治疗组每只大鼠以100μgⅡ型胶原/只大鼠的剂量，尾根部1~2cm
皮下注射0.1mL加强免疫。
2.3 给药方法及标本采集 于加强免疫（实验开始第7天）当天开始给药。消毒饮用水由中日友好医院
临床研究所动物房提供。正常组：每天用消毒饮用水10mL/kg体重的容积灌胃，每日一次，连续28天。模
型组：每天用消毒饮用水10mL/kg体重的容积灌胃，每日一次，连续28天。MTX组：甲氨喋呤混悬液10mL/kg
体重的容积灌胃，每日一次，连续28天，相当于人体用量的5.8倍。小剂量组：补肾祛寒治尪汤全方水煎液
按10mL/kg体重的容积灌胃，每日一次，连续28天，相当于人体用量的2.9倍。中剂量组：补肾祛寒治尪汤
全方水煎液按10mL/kg体重的容积灌胃，每日一次，连续28天，相当于人体用量的5.8倍。高剂量组：补肾
祛寒治尪汤全方水煎液按10mL/kg体重的容积灌胃，每日一次，连续28天，相当于人体用量的11.6倍。标
本采集，脱钙和石蜡块包埋：末次给药24h后，用10%水合氯醛予腹腔内注射麻醉，将动物固定于手术台上，
取左侧膝关节，剔除多余皮毛、肌肉、筋膜等，保留完整的膝关节和滑膜组织于4%多聚甲醛固定液中固定
约1周。然后转入脱钙液（10%甲醛+EDTA超饱和溶液）脱钙8~12周，每1~2周更换脱钙液1次。脱钙完成
后标本依次用梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡块包埋备用。
3. 观测指标
3.1 一般观察项目 1）体重（g）：用药干预后每3天用电子称测各组动物体重。2）一般状况：大鼠
形体、毛色、反应、活动情况、食欲、大小便。
3.2 病理检测
切片制作：切片前在载玻片上涂布蛋白甘油以增强其粘附性能。将石蜡包埋的标本切成4μm厚，于温
水（约42℃）中展平后，捞至载玻片上铺正，用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入60℃温箱烤片24h。
3.2.1 HE染色 1）脱蜡：石蜡切片在烤箱烤干后，浸入（脱蜡专用）二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各15min；2）
水化：依次过梯度酒精：100%Ⅰ→100%Ⅱ→95%Ⅰ→95%Ⅱ→90%→80%→70%
→60%→50%；清水冲洗3 次，流水冲5min；3）染色：切片浸入苏木精溶液染色15min→流水漂洗
5min→0.5%盐酸乙醇分化30s→流水冲洗15min→伊红液复染10min→清水冲洗3次；4）脱水：依次过梯度
酒精：50%→60%→70%→80%→90%→__________100%Ⅰ→100%Ⅱ；5）透明、封固：切片浸入（HE透明专用）二
甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各10min；载玻片上滴加封片胶1滴，加盖玻片封固。6）待切片完全干燥后在光学显微
镜下观察形态，并用DP70数码成像系统拍照。将得到的图像采用表1的评分标准[1]进行分析。
表1 HE普通病理检测项目及评分标准
检测项目 评分标准
0分 滑膜细胞扁平，排列<3层
1分 滑膜细胞肿胀，排列3~4层
（1）滑膜细胞增生
2分 滑膜细胞肿胀，排列5~6层
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检测项目 评分标准
3分 滑膜细胞肿胀，排列>6层
0分 无炎性细胞侵润
1分 炎性细胞散在分布
2分 炎性细胞弥漫分布
（2）炎性细胞浸润
3分 存在淋巴滤泡或生发中心
0分 无新生血管
1分 滑膜轻度新生血管生成，面积<滑膜总面积的1/3
2分 滑膜中度新生血管生成，面积为滑膜总面积的1/3~2/3
（3）新生血管（血管翳）
3分 滑膜重度度新生血管生成，面积>滑膜总面积的2/3
0分 无缺损
1分 局灶性缺损
2分 缺损面积为关节软骨面总面积的1/3~ 2/3
(4)关节软骨破坏
3分 缺损面积>关节软骨面总面积的2/3
3.2.2 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色 抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase，
TRAP）是破骨细胞的特征性标记酶，故TRAP染色通常用于显示破骨细胞的数量、体积和功能状态。1）
准备500mL去离子水，预热至37℃，使用之前确认温度；2）配制修复液：柠檬酸溶液25mL，丙酮65mL 和
37%甲醛8mL，置于磨口玻璃瓶中，将盖子拧紧；3）将修复液保持在室温（18~26℃），将切片浸泡在修
复液中30s进行修复，之后用去离子水完全冲洗切片，注意切勿使切片干燥；4）在试管中加入4mL Fast Garnet
GBC Base Solution和4mL亚硝酸钠溶液，反复倒置30s混匀，然后静置2min；5）将1个500mL烧杯加入下列
试剂，混合，配制孵育液：去离子水（37℃）360mL、步骤5）产物8mL、萘酚AS-BI 磷酸盐溶液4mL、醋
酸盐溶液16mL、酒石酸盐溶液8mL。6）将孵育液从烧杯倒入染缸，在加入切片前用水浴将染缸中的溶液
加温到37℃；7）加入切片，避光，在37℃水浴下孵育1h；8）1h后用去离子水冲洗，然后用苏木素复染40s；
9）置于碱性水中5min以将细胞核染成蓝色；10）使用去离子水封片，并立即在OlymPus光学显微镜下观察，
每张切片在40倍物镜下随机选取5个视野，用DP70数码成像系统进行图像采集，然后对这些视野中的TRAP
标记（+）的细胞进行计数，并计算算术平均值。
3.2.3 RANKL 及OPG 的免疫组化染色 对核因子κB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear
factor-κB ligand，RANKL）和骨保护素（OsteoProtegerin，OPG）进行免疫组化染色。先根据说明书要求
和预试验情况将一抗用抗体稀释液进行稀释，以达到最佳效果。一抗浓度分别为：OPG 1/200，RANKL
1/400。免疫组化染色操作基本过程如下：1）脱蜡：石蜡切片在烤箱烤干后，浸入（脱蜡专用）二甲苯Ⅰ
和二甲苯Ⅱ 各15min ； 2 ） 水化： 依次过梯度酒精：
100%Ⅰ→100%Ⅱ→95%Ⅰ→95%Ⅱ→90%→80%→70%→60%→50%；清水冲洗3 次，然后流水冲5min；3）
氧化：0.2% H2O2氧化15min；4）清水冲洗3次，然后流水冲洗5min；5）0.01M PBS 液洗3次，每次5min；
6）用滤纸吸去多余水分，在切片上滴加一抗，使之完全浸没标本为宜；7）冰箱4℃条件下在湿盒中孵育
过夜，使一抗与抗原充分结合；8）0.01M PBS 液洗3 次，每次5min；9）用滤纸吸去多余水分，在切片上
滴加试剂1（Ploymer HelPer，即用型），在湿盒中孵育1~3h，此次孵育完成后0.01M PBS液洗3次，每次5min；
10）滴加试剂2（二抗，Poly-HRP anti-Goat IgG，即用型），在湿盒中继续孵育1~3h；11）0.01M PBS液洗
3次，每次5min；12）DAB 溶液染色（DAB溶液由中日友好医院临床研究所中心实验室配制，少量DAB
染料粉溶于200mL清水中制成混悬液，现用现配），染色时间OPG为8min，RANKL为3min；13）流水冲
洗2~3min，Mayer 苏木素染料复染1min（着染细胞核）；14）常规流水冲洗10min、脱水、透明、封片、
拍照，同HE染色4）~6）。将得到的图像采用表2进行分析。
表2 免疫组化病理学半定量评分标准[2]
检测项目 评分标准
（1）阳性着色程度 0分 无着色，与背景色一致
1分 浅黄色，略高于背景色
2分 棕黄色，明显高于背景色
3分 棕褐色
（2）阳性细胞所占比例 0分 阴性
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1分 25％以下
2分 25％~50％
3分 5l％一75％
4分 75％以上
两者乘积判定阳性结果，RANKL 和OPG的阳性细胞为胞浆或胞核呈棕黄色或棕褐色。
4 统计学分析
采用excel软件输入、保存资料，SPSS17.0软件进行数据资料的统计分析。计量资料均采用均数±标准
差表示。计量资料的组间比较采用重复计量资料的方差分析，组内比较采用q检验、q’检验或LSD-t检验；
病理学半定量资料的比较采用Mann-Whitney秩和检验进行两两比较。所有统计分析均为双侧检验。
5 实验结果
5.1 各组大鼠一般状态的变化情况 在造模过程中，第二次免疫即加强免疫后（实验第7d开始），除
正常组外，各造模组的大鼠双后肢开始逐渐出现红肿；至加强免疫后第3天（实验第10d），各造模组的大
鼠双后肢都出现明显的发红肿胀，大部分都肿至膝关节甚至双前肢关节处亦有红肿，提示造模成功。与正
常组相比，各造模组大鼠表现为：行动迟缓跋行，食欲减退，体重较前明显开始减轻，活动量明显减少，
毛色欠光泽。（见附录图2）
经西药MTX和中药治疗28天后，正常组:形体正常，反应敏捷，行动迅速，被毛浓密有光泽，紧贴身
体，眼睛明亮活泼，食欲良好，体重稳步增长；模型组:形体瘦弱，反应迟钝，行动缓慢跋行，被毛稀疏、
光泽度查，食欲减退，体重增加少。MTX组：形体和被毛情况较模型组好，反应灵敏度可，关节肿胀的程
度与模型组相比较无改善，行动迟缓跛行，食欲尚可，体重较模型组有增加、增加速度平稳；小剂量组：
形体和被毛情况较模型组好，反应尚可，关节肿胀程度较模型组有改善，行动迟缓、有跛行，食欲可，体
重增加平稳；中剂量组：形体和被毛情况较模型组好，反应灵敏度尚可，关节肿胀程度较模型组有改善，
行动迟缓、无跛行，食欲可，体重增加情况在各造模组表现最好，稳步增长；高剂量组：形体瘦弱，被毛
稀疏、光泽度差，反应较为迟钝，食欲减退明显，体重增加情况、关节肿胀情况与模型组相比较都无改善，
行动迟缓跛行。见表3。
表3 中药治疗28天后各组大鼠的一般情况
组别 只数 形体 毛色 反应 行动 食欲 大小便
正常组 9 丰满 浓密有光泽 敏捷 迅速 良好 正常
模型组 12 消瘦 被毛稀疏、光泽度差迟钝 缓慢跛行 明显减退 偶有腹泻
MTX 组 12 较瘦 被毛较稀疏 尚可 缓慢跛行 食欲稍差 正常
小剂量组 8 较瘦 被毛较稀疏 尚可 缓慢跛行 食欲稍差 正常
中剂量组 9 尚可 被毛略稀 尚可 迟缓、无跛行 食欲尚可 正常
高剂量组 8 较瘦 被毛稀疏、光泽度差较为迟钝缓慢跛行 明显减退 偶有腹泻
5.2 各组大鼠体重变化情况
5.2.1 纵观整个实验过程（0~35d），统计6组大鼠整个实验过程中各次体重的测量数据，经检测各组
大鼠及整体的体重数据均符合正态分布，且检验不符合球形对称条件，故采用重复计量资料的多元方差分
析，结果显示各组大鼠的体重均随时间(t)而变化，有显著统计学意义（P<0.01）；而处理因素与时间交互
作用的P值>0.05，说明处理因素与时间因素无交互作用，即正常组、各治疗组和对照组体重的时间变化没
有差异，这从各组大鼠体重随时间变化的趋势图也可以看出（见图2）。
5.2.2 纵观用药治疗的实验过程（7~35d）,采用重复计量资料的多元方差分析，结果同5.2.1中整个实验
过程得出的结论。
5.2.3 采用单因素方差分析和LSD-t或q或q’检验进行各组之间体重的比较，分别分析挑选出的7个时间
点（0,7,14,17,20,24,35d）的各组大鼠之间体重的差异情况，结果显示：1）实验开始即第1次免疫当天（0d），
各组大鼠之间体重无统计学差异（P>0.05）；2）第2次免疫即加强免疫的当天（7d），各组大鼠之间体重
无统计学差异（P>0.05），也说明第1次免疫后CIA大鼠模型尚未明确显示；3）加强免疫后第7天（14d），
各组大鼠之间体重无统计学差异（P=0.065>0.05）；4）加强免疫后第10天、第13天、第17天和实验结束当
天（17d、20d、24d、35d），各组大鼠之间的体重存在显著统计学差异（P<0.01），说明CIA大鼠的造模
是成功的；
5.2.4 在用药干预的28天的过程中（7d~35d）：1）用药干预的第1天（7d），各组大鼠之间体重无统
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计学差异（P>0.05）；2）用药干预的第7天（14d），正常组与其他各造模组大鼠的体重相比，体重有增
加，但各组之间无统计学差异（P>0.05）；3）用药干预的第10天（17d），各造模组大鼠体重均小于正常
组，中剂量组和正常组之间无统计学差异（P>0.05），而其他各造模组大鼠与正常组相比，有统计学差异
(P<0.05)，且其他各造模组之间：MTX组和小剂量组体重增加值大于模型组，高剂量组体重增加值稍小于
模型组，但各组之间无统计学差异（P>0.05）；4）用药干预的第13天、第17天和第28天（20d、24d、35d），
各造模组大鼠体重均小于正常组，中剂量组和正常组之间无统计学差异（P>0.05），其他各造模组大鼠与
正常组相比有显著统计学差异(P<0.01)，而其他各造模组之间：MTX组和小剂量组体重增加值大于模型组，
高剂量组体重增加值与模型组相似，但各组之间无统计学差异（P>0.05）。见表4（2），图1。
表4（1）
组别 0d 7d 14d 17d 20d 24d 35d
正常组 190.30±18.43 271.80±22.68 287.67±31.00 309.44±36.47 325.44±42.79 341.00±45.97 406.78±49.84
模型组 192.92±20.21 255.33±26.60 263.17±38.06 267.75±42.40 270.92±48.60 279.58±54.31 327.17±67.09
MTX 组 186.33±14.85 255.08±16.73 267.75±20.03 273.67±17.76 283.08±16.55 293.92±20.66 340.25±24.78
小剂量组 191.42±17.12 263.75±20.01 258.30±29.49 270.00±32.09 284.38±38.56 295.88±43.22 339.00±38.12
中剂量组 196.93±20.05 269.07±22.19 274.50±13.13 286.70±19.70 301.90±22.06 313.40±24.17 365.89±36.53
高剂量组 189.64±18.10 264.36±21.49 249.00±22.84 252.11±27.21 263.13±27.86 268.38±28.45 314.63±34.78
表4（2）
组别 0d 7d 14d 17d 20d 24d 35d
正常组 o o o A A A A
模型组 o o o a ao ao ao
MTX 组 o o o a ao ao ao
小剂量组 o o o a ao ao ao
中剂量组 o o o A A A A
高剂量组 o o o a ao ao ao
P<0.05 P<0.01 P<0.01 P<0.01
注：O表示无统计学差异，同一字母的大写字母（如A）优于小写字母（如a）并且具有统计学意义。
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
400.00
450.00
0d 7d 14d 17d 20d 24d 35d
大鼠体重（单位g）
测量时间（单位d）
各组大鼠体重随时间变化趋势
正常组
模型组
MTX组
小剂量中药组
中剂量中药组
高剂量中药组
图2
5.2.5 将各组大鼠实验和治疗前后的体重变化值进行比较，经检验均符合正态分布，进行单因素方差
分析，各造模组大鼠体重的增值均小于正常组，中剂量组和正常组之间无统计学差异（P>0.05），其他各
造模组大鼠与正常组相比有统计学差异(P<0.05)，而其他各造模组之间：MTX 组和小剂量组体重增加值大
于模型组，高剂量组体重增加值与模型组相似，但各组之间无统计学差异（P>0.05）。见表5、图3（1）、
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·21 8·
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图3（2）。
表5 大鼠实验和治疗前后的体重变化情况（单位g）
体重g 分组 正常组 模型组 MTX 组 小剂量组 中剂量组 高剂量组
实验前后 219.11±
55.02
134.25±
70.57
153.92±
32.06
149.63±
44.19
174.11±
53.95
122.25±
40.43
治疗前后 138.44±
51.67
71.83±
73.07
85.17±
32.31 79.88±40.01 101.56±
55.40
48.00±
41.93
216.48
134.25
153.92 147.58
168.96
124.98
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
400.00
450.00
正常组模型组MTX组小剂量中药组中剂量中药组高剂量中药组
大鼠实验前后体重变化
体重变化（单位g）
实验初始体重（单位g）
图3（1）
134.98
71.83
85.17 75.25
96.82
50.27
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
400.00
450.00
正常组模型组MTX组小剂量中药组中剂量中药组高剂量中药组
大鼠治疗前后体重变化
体重变化(单位g)
治疗前体重（7d，单位g）
图3（2）
5.3 中药干预对各组大鼠关节普通病理的影响（HE 染色）
5.3.1 显微镜下观察
5.3.1.1 整体的镜下观察 正常组的大鼠关节结构完整，关节软骨面光滑完整，色泽正常，软骨细胞形
态正常，无肿胀、坏死等，关节间隙正常存在；滑膜无肿胀，细胞扁平，单层规则排列，无增生；无或仅
见少量炎性细胞浸润；未见血管翳增生。（见图3A及附录图3）模型组大鼠关节结构有破坏，以关节面的
软骨破坏为主，大量软骨细胞肿胀、坏死，部分可见骨小梁侵蚀、破坏，关节腔间隙明显变窄；滑膜肿胀、
增厚，细胞分布不规则，呈多层排列，多见滑膜形成关节腔中绒毛结节样突起；关节腔可见大量炎性细胞
浸润；部分滑膜中可见新生血管翳。（见图3B及附录图3）
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·219·
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A 正常组（HE×40） 正常组（HE×100）
B 模型组（HE×100） 图4 整体的镜下观察（HE 染色）
5.3.1.2 各组镜下观察 1)正常组：大鼠关节软骨面光滑完整，色泽正常，软骨细胞形态正常，无肿胀、
坏死等，关节间隙正常存在；滑膜无肿胀，细胞扁平，单层规则排列，无增生；无或仅见少量炎性细胞浸
润；未见血管翳增生，见图5（A）。2)模型组：大鼠关节软骨面存在明显的破坏，大量软骨细胞肿胀、坏
死（核固缩深染等表现），关节腔间隙明显变窄；滑膜肿胀、增厚，细胞分布不规则，呈多层排列，多见
滑膜形成关节腔中绒毛结节样突起；关节腔可见大量炎性细胞（淋巴细胞、巨噬细胞及嗜酸性粒细胞等）
浸润；部分滑膜中可见新生血管翳，见图5（B）。3）MTX组：大鼠关节软骨面存在破坏，有软骨细胞肿
胀、坏死，软骨坏死面积较模型组有减小，余滑膜增生、炎性细胞侵润、新生血管翳均较模型组无改善，
见图5（C）。4）小剂量组：大鼠关节软骨面存在破坏，有软骨细胞肿胀、坏死，软骨坏死面积较模型组
有减小；滑膜肿胀、增厚，细胞分布不规则，呈多层排列，可见滑膜形成关节腔中绒毛结节样突起，但整
体增生的滑膜面积较模型组减小；新生血管翳较模型组有减少；炎性细胞侵润较模型组无改善，见图5（D）。
5）中剂量组：大鼠关节软骨面存在破坏，有软骨细胞肿胀、坏死，软骨坏死面积较模型组明显减小；滑
膜肿胀、增厚，细胞分布不规则，呈多层排列，可见滑膜形成关节腔中绒毛结节样突起，但整体增生的滑
膜面积较模型组明显减小；部分炎性细胞侵润；新生血管翳情况较模型组有改善，见图5（E）。6）高剂
量组：大鼠关节软骨面存在破坏，有软骨细胞肿胀、坏死，软骨坏死面积较模型组有减小；滑膜肿胀、增
厚，细胞分布不规则，呈多层排列，可见滑膜形成关节腔中绒毛结节样突起，但整体增生的滑膜面积较模
型组减小；新生血管翳较模型组减少；炎性细胞侵润情况较模型组无改善，见图5（F）。
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（A） （B）
（C） （D）
（E） （F）
图5 各组膝关节横截面病理形态（HE×200）
5.3.2 HE染色病理评分结果 1) 在滑膜细胞增生方面，只有模型组与正常组比较，滑膜细胞增生较明
显，有显著差异(P<0.01)；而其余各组间差异均没有统计学意义(P>0.05)。2）在炎性细胞浸润方面，统计
结果同1）滑膜细胞增生。3）在新生血管翳方面，各造模组与正常组相比较，存在新生血管翳，有显著差
异(P<0.01)；模型组与各用药组相比较：MTX组与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05)，小剂量组与模
型组之间差异有统计学意义（P<0.05），中、高剂量组与模型组之间差异有显著统计学意义（P<0.01）。4）
在软骨破坏方面，各造模组与正常组相比较，都存在不同程度的软骨破坏，有显著差异(P<0.01)；模型组
与各用药组相比：MTX组与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05)，低、中、高剂量组和与模型组之间差
异有统计学意义（P<0.05）。5）在总积分（滑膜细胞增生+炎性细胞浸润+新生血管翳+软骨破坏）方面，
各造模组与正常组相比较，有显著差异(P<0.01)；模型组与各用药组相比：MTX组与模型组之间差异无统
计学意义(P>0.05)，低、中、高剂量组和与模型组之间差异有统计学意义（P<0.05），以中剂量组的P值最
小，接近0.01（P=0.012）。
以上研究结果表明:CIA大鼠的造模是成功的，并且与人类RA关节局部病理改变非常类似；用药可以改
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·221·
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善大鼠关节病理异常，主要表现在减少新生血管和关节软骨破坏方面，呈一定量效关系，以中剂量中药组
效果最为明显；在滑膜细胞增生和炎性细胞侵润方面，镜下总体观察，用药组较模型组有改善，但半定量
评分无统计学意义的差异；在用药组中MTX 组和小剂量组反应较差。
表6 各组大鼠普通病理（HE染色）的积分
组别 只数 滑膜细胞增生 炎性细胞浸润 新生血管 关节软骨破坏 总积分
正常组 8 0.13±0.35 0.13±0.35 0.00±0.00 0.00±0.00 0.25±0.46
模型组 8 2.63±0.74** 0.92±0.35** 1.75±0.46** 2.50±0.93** 8.75±2.19**
MTX 组 8 2.88±0.35** 1.75±0.46** 1.38±0.52** 1.63±0.74** 7.63±1.41**
小剂量组 8 2.88±0.35** 1.75±0.46** 1.13±0.35** 1.13±0.35** 6.88±1.13**
中剂量组 8 2.38±0.74** 1.50±0.53** 0.75±0.46** 1.13±0.64** 5.75±1.98**
大剂量组 8 2.88±0.35** 1.63±0.52** 0.88±0.35** 1．25±0.46** 6.63±1.30**
注：频数资料，采用秩和检验进行组间比较。与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，P<0.05，
P<0.01。
5.4 TRAP 染色破骨细胞计数结果
TRAP是破骨细胞的特征性酶，破骨细胞在TRAP染色下胞浆红染，即TRAP（＋），胞核可以是1个或
多个。
5.4.1 光镜下可见 1）正常组仅在关节面软骨与骨小梁交界处见到少量TRAP（＋）细胞，通常是单
个出现，见图（A）；2）模型组在关节面软骨、骺板软骨与骨小梁交界处均可见到成群甚至大量分布的TRAP
（＋）细胞，大小不一，其中可见多个多核细胞（见附录图6（B））；3）MTX组主要在关节面软骨与骨
小梁交界处可见成群TRAP （＋）__________细胞，其中有巨型多核细胞，体积明显大于在正常组观察到的同类细胞，
见图6（C）；4）小剂量组主要在关节面软骨与骨小梁交界处可见成群TRAP（＋）细胞，大小不一，见图
6（D）；5）中剂量组主要在骨小梁的骨陷凹中可见部分成群TRAP （＋）细胞，大小不一，见图6（E）；
6）大剂量组主要在关节面软骨与骨小梁交界处可见成群分布的TRAP（＋）细胞，大小不一，其中有巨型
多核细胞，见图6（F）。
（A） （B）
（C） （D）
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（E） （F）
图6 TRAP染色计数破骨细胞（×400）
5.4.2 通过TRAP（＋）的破骨细胞细胞计数（见表7） 1）与正常组相比，各造模组破骨细胞数均有
增多，其中：中剂量组、高剂量组与正常组无统计学意义上的差异（P>0.05）；其他各造模组（模型组、
MTX组、小剂量组）与正常组比较TRAP（＋）细胞数量均明显增多（P<0.01）；2）与模型组相比：中剂
量组、高剂量组的TRAP（＋）细胞数量均明显减少（P<0.01）；MTX组、小剂量组与模型组无统计学差
异（P>0.05）。
表7 各组大鼠TRAP （＋）细胞计数比较
组别 只数 TRAP （+）细胞计数（个/HP）
正常组 8 5.00±2.65
模型组 8 8.90±3.60**
MTX 组 8 6.70±2.85**
小剂量组 8 6.90±3.26**
中剂量组 8 5.10±2.65
高剂量组 8 5.50±3.06
注：频数资料，采用秩和检验进行组间比较。与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，P<0.05，
P<0.01。
5.5 RANKL和OPG免疫组化染色
5.5.1 显微镜下观察 见附录图4。1）在光镜下观察RANKL和OPG的免疫组化切片，染色（＋）部分
呈现黄色至棕褐色。RANKL 和OPG 在关节面软骨细胞、骨细胞、成骨细胞和骺板软骨细胞的胞浆中都
有表达，以关节面软骨细胞的阳性表达最为明显。2）RANKL和OPG在各造模组关节软骨/软骨下骨/骨小
梁区的表达均高于正常组。正常组的关节软骨/软骨下骨/骨小梁区有部分软骨细胞、骨细胞的胞浆中呈现
浅黄褐染色，细胞形态正常、呈圆形；各造模组的关节软骨/软骨下骨/骨小梁区则可见成片的RANKL和OPG
（＋）细胞，胞浆呈棕褐色。
5.5.2 免疫组化染色病理评分结果 见表8（1）。
1）RANKL 和OPG 这2个指标，各组之间阳性细胞所占比例、阳性细胞着色程度、总积分（阳性细
胞所占比例×阳性细胞着色程度）都存在显著的统计学差异（P<0.01或P<0.05）；
2）RANKL染色结果显示：阳性细胞所占比例情况：与正常组相比，模型组和高剂量组的阳性表达都
明显升高（P<0.01）；MTX组、小剂量组阳性表达升高（P<0.05）；中剂量组阳性表达在数值上有升高，
但无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，MTX组、中剂量组的阳性表达降低（P<0.05）；小剂量组和
高剂量组的阳性表达在数值上有降低，但无统计学意义（P>0.05）。阳性细胞着色程度：与正常组相比，
小剂量组和高剂量组的阳性表达均明显升高（P<0.01）；模型组、MTX 组的阳性表达都升高（P<0.05）；
中剂量组阳性表达在数值上有升高，但无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，各用药组的阳性表达在
数值上有降低，但无统计学意义（P>0.05）。总积分：与正常组相比，模型组、MTX组、小剂量组和高剂
量组的阳性表达都明显升高（P<0.01）；中剂量组阳性表达在数值上有升高，但无统计学意义（P>0.05）。
与模型组相比，各用药组的阳性表达在数值上有降低，但无统计学意义（P>0.05）。
3）OPG 染色结果显示：阳性细胞所占比例情况：与正常组相比，小剂量、中剂量和高剂量组的阳性
表达都明显升高（P<0.01）；模型组、MTX组的阳性表达升高（P<0.05）。与模型组相比，各用药组的阳
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性表达无统计学意义的差异（P>0.05）。
阳性细胞着色程度：与正常组相比，小剂量组的阳性表达明显升高（P<0.01）；模型组、中剂量组、
高剂量组的阳性表达都升高（P<0.05）；MTX 组阳性表达在数值上有升高，但无统计学意义（P>0.05）。
与模型组相比，各用药组的阳性表达无统计学意义的差异（P>0.05）。
总积分：与正常组相比，小剂量组、中剂量组、高剂量组的阳性表达都明显升高（P<0.01）；模型组
的阳性表达升高（P<0.05）；MTX 组阳性表达在数值上有升高，但无统计学意义（P>0.05）。与模型组
相比，各用药组的阳性表达无统计学意义的差异（P>0.05）。
4）OPG/RANKL：将各组免疫组化的总评分进行OPG/RANKL 的相除计算，可见在数值上，正常组
和MTX 组、小剂量中药组要高于模型组，但各组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表8（2）。
表8（1） 各组大鼠RANKL 和OPG（免疫组化染色）的积分
RANKL 只
数
阳性细胞所
占比例
阳性细胞着
色程度
总积分 OPG 阳性细胞所
占比例
阳性细胞着
色程度
总积分
正常 8 1.88±0.35 2.13±0.64 4.00±1.5
1 正常 1.63±0.52 2.00±0.76 3.50±2.0
0
模型 8 3.13±0.64** 2.88±0.35* 9.13±2.4
7** 模型 2.75±1.04* 2.75±0.46* 7.88±3.6
0*
MTX 8 2.38±0.52* 2.88±0.35* 6.88±1.8
9** MTX 2.25±0.71* 2.63±0.52 5.88±2.2
3
小剂量 8 2.63±0.52* 3.00±0.00
**
7.88±1.5
5
**
小剂量 2.50±0.53** 3.00±0.00*
*
7.50±1.6
0**
中剂量 8 2.38±0.74 2.50±0.53 6.13±2.9
5 中剂量 2.88±0.64** 2.75±0.46* 8.13±2.7
5**
高剂量 8 3.00±0.00** 3.00±0.00** 9.00±0.0
0** 高剂量 3.38±0.74** 2.88±0.35* 9.88±2.8
0**
表8（2） 各组大鼠OPG/RANKL 的比值
组别 只数 OPG/RANKL
正常组 8 1.03±0.90
模型组 8 0.91±0.43
MTX 组 8 0.94±0.49
小剂量组 8 1.00±0.35
中剂量组 8 1.50±0.68
高剂量组 8 1.10±0.31
注：频数资料，采用秩和检验进行组间比较。与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，P<0.05，
P<0.01。
6 结论与讨论
6.1 实验结论 将实验结果综合分析：1）补肾祛寒治尪汤治疗胶原诱导型关节炎大鼠（CIA 大鼠）时，
可以延缓CIA 大鼠膝关节的骨质破坏；考虑是通过影响OPG/RANK/RANKL 系统来抑制破骨细胞活性，
从而延缓膝关节的骨质破坏；2）常规剂量（即实验中中剂量中药组）的补肾祛寒治尪汤，在CIA 大鼠的
体重、食欲、反应、行动等整体各方面，是包括西药MTX 组在内的各用药组中从宏观到微观病情缓解最
为明显的一组，故考虑本方应用于临床可改善RA 患者整体的病情和反应情况，同时应该作用于RA 疾病
过程中多个环节、多个靶点；3）常规剂量的补肾祛寒治尪汤针对RA 骨破坏是有效果的而且无明显不良反
应，故可长期应用于临床，还可进一步完善相关的基础实验研究，并可考虑成方的研发推广和应用。
具体分析，在体重方面：与模型组比较，MTX 组、小剂量组、中剂量组均能改善大鼠的体重，中剂
量组最为明显，但大剂量组对体重改善无效。在膝关节局部的病理学方面：1）HE 染色：用药可以改善大
鼠关节病理异常，主要表现在减少新生血管和关节软骨破坏方面，呈一定量效关系，以中剂量组效果最为
明显；在滑膜细胞增生和炎性细胞侵润方面，镜下总体观察，用药组较模型组有改善，但半定量评分无统
计学意义的差异；在用药组中MTX 组和小剂量组反应较差。2）TRAP 染色破骨细胞计数：用药可以减少
破骨细胞的生成，以中剂量和高剂量组的效果最为明显，在用药组中MTX 组和小剂量组反应较差。3）
RANKL 和OPG 免疫组化染色：本实验中，RANKL 在各造模组中的表达都明显高于正常组，OPG 的表达
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也明显增高，考虑可能是TNF-α 等炎症因子刺激成骨细胞所致，属于机体的负反馈调节作用。
实验结果显示，MTX 和中药各组都可降低RANKL 的水平，中药各组呈一定的量效关系，以中剂量
组最为明显；MTX 组亦较为明显；这样即可通过OPG/RANK/RANKL 系统达到抑制破骨细胞的分化、生
成和活性的目的，进而减缓RA 的骨侵蚀。与模型组相比，各中药组对OPG 的影响不明显。
6.2 关于补肾祛寒治尪汤 焦树德先生认为“尪痹”（RA）的病因病机为素体肾虚,寒湿邪盛深侵入肾,
或先天凛赋不足或后天失养,遗精滑精,房室过度,劳累过极,产后失血,月经过多等而致肾虚,正不御邪；冬季
寒盛,感受三邪,肾气应之,寒袭入肾；其复感三邪,内舍肝肾；寒湿贼风,痰浊瘀血,互为胶结,凝聚不散。尪痹
与其他痹病不同之处主要在于为寒湿之邪深侵入肾,并影响到肝, 骨损筋挛，病情更为深重。
补肾祛寒治尪汤是焦树德先生针对“尪痹”（RA）拟定的一个基础方，此方适用于肾虚寒盛证，是根据
《金匮要略》中桂枝芍药知母汤合《和剂局方》虎骨散加减化裁而成[3]，方中：川续断、补骨脂补肾壮筋
骨，制附片补肾阳、祛寒邪，熟地黄填精补血、补养肝肾为主药；骨碎补、淫羊藿温补肾阳、强壮筋骨，
桂枝、独活、威灵仙搜散筋骨肢体风寒湿邪，白芍养血荣筋、缓急舒挛为辅药；防风散风，麻黄散寒，苍
术祛湿，赤芍化瘀清热，知母滋肾清热，山甲通经散结，地鳖虫活瘀壮骨，伸筋草舒筋活络，松节通利关
节为佐药；牛膝下行引药入肾为使药，共奏补肝肾，强筋壮骨，祛除风寒湿邪，化瘀通络之功。结合焦树
德先生对尪痹(RA)病因病机的认识，可以看出此方以补肝肾为基础，肾为重中之重，而在前文的综述中已
经讨论了“肾主骨”，肾与骨的关系密切，故从本方的立法处方用药方面都考虑到了延缓尪痹（RA）的骨质
损伤，并且在临床应用中也取得了良好的疗效，有临床个案的报道[4-6]，且导师王伟钢[7]曾以补肾祛寒治尪
汤为基础加减治疗RA患者38例，2个月为1个疗程，观察1~3个疗程，如治疗前已服用肾上腺皮质激素或非
甾体抗炎药物的患者可先维持原剂量，待开始中药治疗后，逐渐将西药减量至撤除；根据中国中医药学会
痹病专业委员会制定的疗效判定标准，结果显示：38例中临床治愈3例、显效8例、好转22例、无效5例，
愈显率28.95%，总有效率86.84%；在治疗前后的关节数方面疼痛消失为252个、改善的348个、无变化或加
重的为88个，消失和改善的占87.21%；肿胀消失165个、改善137个、无变化或加重69个，消失和改善的占
80.32%；RA 晨僵时间治疗前平均为（89.34±13.79）min，治疗后为（46.26±8.00）min，有显著的统计学
差异（P<0.01）；其他临床症状（关节喜暖怕冷、腰腿酸软、倦怠、关节功能、握力、提重力、蹬力、20
米步行时间、蹬阶时间）在治疗前后都有不同程度的改善。
在前期也已经有师兄师姐对本方进行了全方和拆方的基础实验研究，表明补肾祛寒治尪汤全方的实验
疗效最佳，能适当纠正CIA 模型大鼠的体重减轻，对关节炎症肿胀有显著抑制作用，能显著降低血清中
IL-2、TNFα水平(P<0.05)，与MTX 组显著差异，而且全方引起脾脏萎缩的程度较MTX 组轻，因此考虑补
肾祛寒治尪汤可直接或间接抑制RA关节的炎症情况和关节软骨、骨的破坏，同时副作用较MTX小；其中
补肾组和祛邪组中药都能有效改善大鼠关节局部肿胀，祛邪组中药可有效降低血清中IL-2、TNFα的水平，
且补肾+祛邪组中药能够显著减低CIA大鼠的发病峰值，推迟峰值出现时间，缓病情发展速度；活血组与模
型组相比可改善大鼠足肿胀度、降低血清中TNFα 的水平，但疗效不及补肾、祛邪等其他用药组[8]。
6.3 补肾祛寒治尪汤对RA骨侵蚀OPG/RANK/RANKL系统的调控 破骨细胞（OC）在包括RA在内的
疾病导致的骨破坏过程中处于核心地位，在骨破坏的过程中破骨细胞活化和表达增加，最终导致骨破坏。
而OPG/RANK/RANKL系统则在破骨细胞的分化激活过程中发挥重要作用，这些在前文的综述中已经有所
论述。故抑制RA 关节中RANKL的表达以及促进OPG 的表达成为防治RA关节骨质破坏的有效途径，通过
分析OPG/RANKL比值筛选相关药物也有了实际意义。本实验表明，补肾祛寒治尪汤可下调CIA大鼠膝关
节软骨组织中RANKL表达的水平，对OPG 表达的影响则不明显。
本实验的结果显示，首先，西药MTX和中药各组都能降低RANKL水平，以中剂量组和MTX组明显，
这样进而就可以减少破骨细胞的活化，延缓骨质的破坏。从中医角度分析，“肾主骨”，肾气应于冬，寒为
冬之性，故风寒湿邪侵入经络关节导致痹证（RA），故从肾论治可收良效，补肾祛寒治尪汤中川断、补骨
脂、熟地、制附片、骨碎补、淫羊藿、川牛膝等药物均有补益肝肾、强筋壮骨的功效，故可改善RA 骨质
破坏的情况。其次，关于OPG，其在各造模组中的表达也都明显高于正常组，与模型组相比，MTX组和小
剂量组的表达有降低，而中、高剂量组的OPG 表达则升高，但各组之间无统计学意义；第三，关于
OPG/RANKL比值，在正常组和各用药组都较为恒定，与模型组区别不是太明显，而各治疗组的
OPG/RANKL与模型组相比无统计学差异，故关于本方抑制CIA大鼠膝关节骨损伤的机制与影响OPG表达
是否相关，以及本方小剂量长期用药是否可促进OPG 表达尚有待研究。
由本实验结果可知，抑制关节软骨和骨组织中RANKL 的表达为补肾祛寒治尪汤抑制RA关节软骨和骨
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破坏的机制之一，值得进一步探讨，同时该方用药剂量对OPG表达的影响还可进行研究，进一步阐明补肾
祛寒治尪汤对OPG/RANK/RANKL系统的作用。
此外，本实验结果表明与模型组、中药组相比，西药甲氨喋呤（MTX）对CIA大鼠关节OPG的表达是
有抑制作用的，故关于MTX对RA 骨破坏产生治疗作用也可能是通过OPG/RANK/RANKL系统产生作用
的，也可进一步进行文献资料的搜集、分析和实验研究。
6.4 对本实验过程中一些问题的思考和分析
6.4.1 此次实验我们选用了甲氨喋呤(MTX)作为西药对照组，而且剂量选择了临床实践中人体应用偏高
的剂量30mg/w。MTX 作为目前DMARDs中的“基石”药物，这在2010年美国风湿病学会和欧洲风湿病学会
联合制定的新的关于RA指南中也有提到，是DAMARs中被首先推荐应用于RA 临床治疗的，其同时作用于
RA 炎症和骨质破坏的过程；而且，在大量的临床和基础实验中，MTX都是被用作标准对照药物，也有着
良好的效果。但在此次实验，作为西药对照组的MTX组大鼠在整个实验过程中反应并不好，最主要表现在
肉眼观察MTX组大鼠的关节肿胀程度与模型组相差无几，而且后来镜下观察也发现MTX组大鼠的膝关节
有大量炎细胞侵润、滑膜增生和部分软骨破坏。这与其他很多临床和基础实验的情况并不相符。曾查阅部
分文献，也提到MTX在临床的疗效个体差异较大，近几年有提出因为遗传基因的差异，导致部分人的机体
对MTX不敏感。但这种情况在一般的基础实验中并没有出现，而且MTX组虽然膝关节红肿明显、行动不
便，但与模型组和其他中药组比较，其食欲和精神尚可，并没有出现在有些研究中提到的MTX剂量偏大就
有可能出现胃肠道、造血系统等不良反应。综合考虑，我们大胆推测，此次实验中MTX疗效差最有可能的
原因为药物质量问题，药物的有效成分不足，需要在以后的实验中多加注意。
6.4.2 在此次实验过程中，设立了3个剂量的中药组：小剂量、中剂量和高剂量组。在实验整个过程中
实验动物的一般状态、体重以及膝关节的病理学检查结果显示，高剂量中药组（补肾祛寒治尪汤）的反应
都不是很好，死亡数量也最多。尤其是在给大鼠灌胃的过程中，虽然有很大一部分因素是因为我们自身灌
胃技术不熟练，导致在用药前期中药各组的大鼠因灌胃有不同程度的死亡，但高剂量中药组的大鼠在除却
我们自身灌胃问题外，与其他各剂量中药组及MTX 组相比，在一般状态（尤其是食欲方面）、体重、膝
踝关节肿胀情况方面都与模型组相差无几，甚至更差。故考虑本方（补肾祛寒治尪汤）在剂量过大时，可
能存在不良反应，尤其是胃肠道的不良反应，导致大鼠食欲差、体重增长缓慢而且药物吸收不良。出于这
方面的考虑，本人进行了关于中药不良反应和毒性，以及组成本方的21味中药可能存在的不良反应和毒性，
这两方面的文献检索。具体到本次实验所用的补肾祛寒治尪汤，共有21味中药，兼顾补肾强筋骨、祛邪、
活血、健脾利湿之功效。在这21味中药中，常见的容易产生不良反应甚至毒性的药物有：制附片、补骨脂、
白芍、威灵仙、麻黄、地鳖虫。而这几种中药常见的不良反应主要涉及循环系统、神经系统、消化系统（包
括胃肠道不良反应和肝功能）、泌尿系统（包括肾功能）、皮肤等至全身的过敏反应等。这几种中药本身
亦含有一些典型的可引起不良反应甚至毒性的中药成分，如乌头碱、补骨脂酚、疑似马兜铃酸成分、白芍
总苷、麻黄素，等等；且部分与药物剂量的大小，药物煎煮的时间有很密切的关系。所以，在此次实验中，
高剂量中药组的大鼠反应不好不能排除是因中药不良反应导致的。至于是何种中药及成分，到何种剂量和
用药时间时大鼠便不能再耐受，则需要更进一步的研究和探索，可以进行文献检索收集后定量统计分析的
理论研究，而且补肾祛寒治尪汤为一个整方，各种药物及成分之间通过配伍和相互作用也会产生增效、减
毒等方面的作用，故可以考虑以全方、部分拆方等方式来进行本方不良反应甚至毒性的研究。这对本方将
来的开发、利用和推广也是必不可少的。
6.4.3 在查阅文献的过程中，了解到了在RA 导致关节破坏最终残疾的过程中，关节软骨和软骨细胞损
伤也是很重要的一个过程，而且近几年已经有一些研究涉及该方面。而在此次实验过程中，我们也发现在
35天实验的周期中大鼠关节面软骨的损伤和一些抗体的表达都是比较明显的，故可以考虑探索补肾祛寒治
尪汤对关节软骨的影响。
6.4.4 此次实验已经表明补肾祛寒治尪汤全方通过OPG/RANK/RANKL系统的作用对破骨细胞有抑制
作用，而且主要是对RANKL产生影响，进而延缓RA骨质破坏；而近年来研究发现关于RANKL对破骨细胞
的激活分化等过程则主要是通过4条信号转导通路实现的：如首先 RANKL与RANK结合，激活肿瘤坏死因
子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor6，TRAF6)，再刺激Tc1细胞核因子(nuclear factor of activated
T cellsc1，NFATc1)，进而达到OC的分化和激活；其次，RANKL激活c-Fos/AP-1，通过这二者再刺激NFATc1
以分化OC等等[9-10]。故可以考虑进一步探究补肾祛寒治尪汤对RANKL信号通路的影响。
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