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[size=24]寻常性银屑病患者外周血Th17 细胞相关因子的表达[/size]

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周启鑫

周启鑫
Admin

刘栋1 廖非2 李雅琳1 徐丽敏1 焦振山1
(1 天津市中医药研究院附属长征医院皮肤科,天津 300021;2 苏州市第五人民医院皮肤科,苏州,215007)
摘要 目的:探讨Th17 细胞相关因子IL-23、IL-17A、IL-17F、IL-22 与银屑病的关系与意义。方法: 30 例
寻常性银屑病患者分为进行期15 例,静止期15 例,30 例正常人对照,取外周血,采用双抗体夹心ELISA
法检测血浆IL-23 的含量,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative-reverse
transcriptase-polymerase chain reaction, FQ-RT-PCR)技术检测外周血外周血单个核细胞(PBMC)IL-17A
mRNA、IL-17F mRNA、IL-22 mRNA 的相对表达量。结果:进行期银屑病患者血浆IL-23 浓度、PBMC IL-17A
mRNA、IL-17F mRNA、IL-22 mRNA 的表达均明显高于正常对照组,进行期患者PBMC IL-17A mRNA、
IL-22 mRNA 的表达高于稳定期患者,而稳定期患者上述指标的表达与正常对照无明显差异。结论: Th17
细胞可能参与寻常性进行期银屑病病理过程。
关键词 银屑病;Th17 细胞;IL-23
Expressions of the Th17 cells related cytokins in psoriasis vulgaris
Liu Dong Liao Fei Li Yalin Qiao Shufang Xu Limin Jiao Zhenshan
(Department of Dermatology, Tianjin Chang Zheng Hospital, Tianjin, China, Post code: 300021)
第九届世界中医药大会
The 9th World Congress of Chinese Medicine
·239·
实 验 研 究
Experimental study
Abstract Obectives: To detect the expressions of Th17 cells related cytokines including IL-17A, IL-17F, IL-22
and IL-23 in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris, and further to illustrate the pathogensis of
psoriasis vulgaris. Methods: Peripheral blood was obtained from 15 patients with stable psoriasis vulgaris, 15
progressive psoriasis vulgaris and 30 healthy controls. The level of IL-23 in plasma was determined by ELISA,
And the mRNA expressions of IL-17A, IL-17F and IL-22 in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) were
detected by FQ- RT-PCR. Results: The level of IL-23 in progressive psoriasis was significantly higher than that of
healthy control (P=0.002). But The level of IL-23 in stable psoriasis was no significantly different with the control
group (P=0.169). The levels of IL-17A mRNA、IL-17F mRNA、IL-22 mRNA in progressive psoriasis were
significantly higher than that of the control group(P=0.007;P=0.015;P=0.002). The levels of IL-17A mRNA、
IL-22 mRNA in progressive psoriasis were significantly higher than that in stable psoriasis except IL-17F mRNA.
Conclusions: Th17 cells may take part in the pathogenesis of progressive psoriasis vulgaris.
Key words psoriasis; T helper 17 cell; Interleukin-23
Th17 细胞是新近发现的一种T 辅助细胞亚群,由外周血幼稚CD4+T 细胞前体细胞分化而来,它不合
成产生IL-4 或IFN-γ,而特征性的分泌IL-17A(IL-17),IL-17F,IL-21,IL-22 等。Th17 细胞具有独立的
分化和发育调节机制,在免疫性疾病和感染性疾病中发挥重要调节作用[1]研究中通过检测Th17 细胞相关因
子在银屑病外周血中的表达,初步探讨Th17 细胞与银屑病的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病例资料 30 例寻常型银屑病患者,男性18 人,女性12 人,年龄11~65 岁,平均年龄35.8±11.66
岁,近3 个月内未接受系统性治疗及外用药治疗,无伴发其他免疫性疾病和系统性疾病,其病情严重程度
依据银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)计分法评估,平均积分值为11.2(3~30.4)。30 例患者中进
行期15 例,平均年龄(32.46±10.3)岁,静止期15 例,平均年龄(30.85±13.21)岁;正常对照组:为同
期性别和年龄与之相应的健康查体者30 例,男性16 人,女性14 人,年龄10~60 岁,平均年龄(34.65±10.28)
岁。所有测试项目均经患者本人同意。
1.1.2 试剂和仪器 全血RNAOUT 试剂盒、液相RNA 酶抑制剂(天泽基因有限公司),SYBR ExScriptTM
RT-PCR Kit 购自大连宝生物公司,DNA Maker、IL-17A、IL-17F、IL-22 及内对照ACTIN 引物根据pubmed
基因库提供的等位基因核苷酸序列,由大连宝生物(TaKaRa)公司设计合成, 人血浆IL-23 定量酶联检测
试剂盒(ADL)。多功能酶标仪为SPECTRA-III 型,RG-3000 荧光定量PCR 仪(澳大利亚),凝胶成像系
统 (英国UVItec 公司)。
1.2 方法
1.2.1 血浆IL-23 浓度的测定 取银屑病患者和正常对照组静脉血5mL,2000rps,20min,分离血浆及
血细胞。严格按照IL-23 定量酶联检测试剂盒操作说明测定血清IL-23 浓度。结果判断:放置于波长450nm
的酶标仪读取各孔吸光度A450nm 值,建立标准曲线。每个样品制备三个复孔,敏感度:1.0pg/mL。
1.2.2 PBMC IL-17A mRNA, IL-17F mRNA, IL-22 mRNA 的相对表达量的测定 按照全血RNAOUT
试剂盒说明步骤提取总RNA,提取出的RNA 用紫外分光光度计测定其纯度及浓度(A260/A280 的比值在
1.8-2.0 之间),溶于液相RNA 酶抑制剂。RT-PCR:冰上配置RT 反应体系,包括总RNA 2μL, 5×PrimeScriptTM
Buffer 2μL,PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5μL,Oligo dt Primer 0.5μL,Random 6 mers 0.5μL,Rnase Free
dH2O 4.5μL,总体积为10μL。混匀后,瞬时离心。37oC 反应15min,85oC 反应5sec,得到的c DNA-20oC
保存或直接行PCR 扩增。 冰上配置PCR 反应体系,其中SYBR Prime Ex TaqTM (2×) 12.5μL,上游引物
(10Mm)0.5μL,下游引物(10Mm)0.5μL,d H2O 9.5μL,c DNA 模板 2.0μL,总体积为25μL。IL-17A:
上游引物为5’ CCACCTCACCTTGGAATCTC 3’, 下游引物:5’ CAGGATCTCTTGCTGGATGG 3’,预期
扩增片段为152bp ; IL-17F : 上游引物: 5’GTGTAGGAACTTGGGCTGCATCAAT3’ , 下游引物:
5’AGTGGATATGCACCTCTTACTGCACA3’ , 预期扩增片段为123bp ; IL-22 : 上游引物:
5’ACAACACAGACGTTCGTCTCATTG3’, 下游引物:5’GAACAGCACTTCTTCAAGGGTGA3’,预期扩
增片段为113bp; 同时设ACTIN 为内参照物,其上游引物:5’TGGCACCCAGCACAATGAA3’, 下游引
物:5’CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA3’, 预期扩增片段为186bp。扩增反应在相同条件下不同试
管中分别进行。扩增条件为:95 oC 10sec,95 oC 5sec,62 oC 20sec。以无RNA 酶的水代替cDNA 模板
作为阴性对照,PCR 反应在RG-3000 荧光定量PCR 仪进行。基因表达相对变化采用△△Ct 法处理数据。
PCR 反应产物特异性鉴定:反应结束后进行溶解曲线分析,分析其是否为特异性产物。制备4%琼脂糖凝
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·24 0·
实 验 研 究
Experimental study
胶,加2μL 6×上样缓冲液于8μL PCR 产物中,混匀后加样于琼脂糖凝胶加样孔中,电压120V,10min,
电压100V,40min。电泳结束后,用UVI 凝胶扫描系统对凝胶进行扫描。
1.3 统计学分析 计量资料以均数±标准差( x ±s)表示,多个样本均数间的比较采用方差分析。所用
数据运用SPSS13.0 软件进行统计。
2 结 果
2.1 银屑病血浆IL-23 水平的测定 银屑病进行期患者血浆IL-23 浓度与正常对照组相比明显增高
(P=0.002),;银屑病稳定期患者血浆IL-23 浓度与正常对照组相比虽有增高趋势,但无统计学意义,银屑
病进行期与稳定期患者血浆IL-23 浓度无统计学差异(P=0.192)(表1)。
表 1 银屑病患者与正常对照组血浆IL-23 浓度比较(ng/L, x ±s)
组间比较 组别 例数 x ±s F 值
2 3
正常对照组 30 160.5133±66.2382 0.002 0.169
银屑病进行期 15 291.4258±114.7820 0.192
银屑病稳定期 15 217.0628±99.4012
10.973
2.2 目标基因IL-17A、IL-17F、IL-22 扩增产物的鉴定 IL-17A 152bp 扩增片段、IL-17F 123bp 扩增
片段、IL-22 113bp 扩增片段分别用4%琼脂糖凝胶电泳,扩增片段长度与理论大小一致(图1-3)。
图 1 IL-17A mRNA 扩增产物电泳图
图 2 IL-17F mRNA 扩增产物电泳图
300bp
250bp
200bp
150bp
100bp
50bp
300bp
250bp
200bp
150bp
100bp
50bp
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实 验 研 究
Experimental study
图3 IL-22 mRNA 扩增产物电泳图
2.3 银屑病患者PBMC IL-17A mRNA、IL-17F mRNA、IL-22 mRNA 的表达 银屑病进行期患者与
正常对照组相比PBMC IL-17A mRNA、IL-17F mRNA、IL-22 mRNA 的相对表达量均明显高于(P=0.007;
P=0.015;P=0.002);稳定期银屑病患者与正常对照组相比PBMC IL-17A mRNA、IL-17F mRNA、IL-22
mRNA 的相对表达量高于正常对照组,但无显著性差异,(P=0.8755; P=0.675; P=0.55); 银屑病进行期患者
与稳定期银屑病患者PBMC IL-17A mRNA、IL-22 mRNA 的相对表达量有统计学差异(P=0.005;P=0.023);
而IL-17F 无显著差异(表2)。
表2 银屑病患者PBMC IL-17A mRNA、IL-17F mRNA、IL-22 mRNA 的表达
组别 例数 IL-17A mRNA IL-17F mRNA IL-22 mRNA
银屑病进行期
银屑病稳定期
正常对照组
15
15
30
18.4548±6.6164
13.128±2.4627
11.6338±3.8365
13.6880±2.2970
12.1809±2.2164
11.5315±1.8202
16.2808±3.8249
12.8065±2.6087
11.9115±1.4917
3 讨 论
Th17 细胞是一种新型的T 辅助细胞亚群,与经典的Th1、Th2 辅助细胞不同,具有独立的分化和发育
调节机制,在自身免疫性疾病和炎症性疾病中介导免疫损伤。Th17 细胞通过其分泌的细胞因子发挥效应,
主要分泌的细胞因子为IL-17(IL-17A)、IL-17F、IL-22,其中IL-17 被认为是Th17 细胞产生的最主要的、
可以标志其亚群的细胞因子。IL-17 家族包含六个成员(IL-17A~F)[2]。 IL-22 是Th17 细胞分泌的另外一种
主要的细胞因子,IL-22 可与IL-17 发挥协同调节作用,参与Th17 细胞的效应功能,造成相应的炎症反应
和组织破坏[3]。IL-23 是调控Th17 细胞的重要细胞因子,可促进IL-17 表达,介导Th17 细胞效应[4]。
越来越多的证据表明Th17 细胞参与了银屑病的病理过程,Blauvelt A 等[5]发现银屑病皮损中IL-17A
与TNF-а 较正常皮肤对照组显著升高,而两组中Th1 特异细胞因子IFN-7 没有显著性差异。IL-17 可以提
高中性粒细胞趋化性,这与银屑病皮损血管周围中性粒细胞聚集浸润局部聚集形成微脓疡的病理特点相
符。银屑病患者的皮损和血清中IL-22 增高,并且和疾病的严重程度平行。体外实验证实IL-22 可以诱导
人类角质形成细胞增生。最近的一项研究发现,依那西普治疗银屑病后血清IL-17、IL-22 水平较治疗前明
显下降[6]。银屑病病人用针对IL-12/23p40 的单克隆抗体治疗后,临床上有显效,这提示IL-23 在银屑病发
病中起到重要作用[7]。
本研究发现进行期银屑病患者与正常对照组相比,血浆IL-23浓度、PBMC IL-17A mRNA、IL-17F
mRNA、IL-22 mRNA的相对表达量增高,而稳定期银屑病患者与正常对照组相比,上述指标虽有增高趋势,
但无统计学意义。银屑病进行期患者PBMC IL-17A mRNA、IL-22 mRNA的表达较稳定期患者增高,而IL-17F
无显著差异。上述结果提示Th17细胞相关因子IL-23、IL-17A、IL-17F、L-22与银屑病的发病有关,且主要
参与了进行期银屑病的病理过程。近期有作者发现银屑病外周血Th17、IL-17、IL-2水平与PASI评分成正相
关,随着PASI评分增高,其表达量随之升高[8],这与我们发现的进行期银屑病Th17细胞相关因子水平增高
300bp
250bp
200bp
150bp
100bp
50bp
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实 验 研 究
Experimental study
有一定的一致性。
参考文献
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