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[size=24]糖肾方治疗糖尿病肾病的转化医学研究[/size]

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李平
(卫生部中日友好医院,北京,100029)
摘要 目的:通过临床研究验证糖肾方的有效性和安全性,通过基础研究阐明药物的作用机制,为新药研
发提供客观依据。方法:在继承已故名老中医时振声教授治疗和当代名医吕仁和教授治疗糖尿病肾病临床
经验的基础上,采取回顾性分析、专家和患者问卷,结合糖尿病肾病中医症候规律的科学发现,以益气养
阴活血通络法为治则开发了中药复方——糖肾方,采用多中心、随机、双盲、安慰剂平行对照研究评价了
该法干预气阴两虚夹瘀型2 型糖尿病肾病的疗效;利用代谢组学方法系统阐明了益气养阴活血通络法治疗
糖尿病肾病的整体效应,并发现了与该效应相对应的代谢标志物群;通过体内动物实验和蛋白质组学技术
阐释了其作用机制。结果:临床研究发现糖肾方联合西医基础治疗在降低DN 尿白蛋白排泄率、改善脂代
谢、保护肾功能、降低中医证候积分方面具有优于单纯西药治疗的优势。代谢组学研究发现的多种重要代
谢标志物进一步证实了磷脂代谢通路、脂肪酸代谢通路、嘌呤和嘧啶代谢通路、硫醇氨基酸代谢通路中与
糖尿病肾病的病理病因病机密切相关。结论:糖肾方是一个具有开发前景的治疗糖尿病肾病复方中药制剂。
关键词 糖肾方;糖尿病肾病;临床试验;动物实验;代谢组学
Treatment of diabetic nephropathy by chinese medicine from b2b
Ping Li
(Institute of Clinical Medical Science, China-Japan Friendship Hospital, Yinghua Donglu, Hepingli Chaoyang
District, Beijing, P.R. China 100029,)
Two herbal medicine formulae were developedfor the treatment of Diabetic nephropathy. Diabetic
nephropathy (DN) has surpassed other major diseases to become the most common cause of the end-stage renal
disease. The major cause of DN is due to microvascular disease in the glomerular and eventually develops
glomerulosclerosis. The therapeutical methods for DN are quite limited in western medicine, therefore it is
necessary to hunt for new treatment for DN from Chinese medicine. Two herbal medicine formulae were
developed on the combination of the modern research with senior doctors’ experiences of in China. One is
Chaihuang-Yishen Granule(CHYS) composed of seven Chinese herbs, which was originally used for treating
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chronic kidney disease. The other is Tangshen Formula (TSF) composed of seven Chinese herbs, which was
widely used for DN in Beijing.
Animal Experiments to verify the efficiency of the two herbal Medicine. Diabetic rats’ models were
established by receiving a right uninephrectomyplus a single intraperitoneally injection of STZ, then the effect of
CHYS and TSF were examined. Then the action mechanisms were investigated by RT-PCR, western blot,
immunohistochemical staining and so on.OLETF rats model was also used to verify the effect of TSF. The
potential proteins were demonstrated in OLETF rats compared with LETO rats by Proteomic analysis.
Clinical Trial of Tangshen Formula on DN A multicentric, randomized, placebo-controlled trial was carried out
to observe the effect of TSF on 181 patients with type 2 diabetic kidney diseases. There were significant reduction
of urinary albumin excretion rate in patients with DN stage III and stage IV in TSF treatment group compared
with placebo. We also find out that there were significant reduction of serum creatinine and elevation of eGFR
level in the treated group. But, the effect was not related with blood pressure, age and gender. Meanwhile, nine
phospolipids were examined by metabonomic study in DN patients. After the treatment of TSF, the level of
plasma phospholipids were close to normal.
Conclusion: TSF is a potential drug for the treatment of diabetic nephropathy.
在对糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)中医证候分布规律及中医病机研究基础上,我们系统梳
理了DN 的中医文献资料,总结我国已故著名中医肾脏病专家时振声教授治疗DN 的临证经验,认为益气
养阴活血通络为DN 中医治疗的主要治则之一,并进行了以益气养阴活血通络立法的糖肾胶囊治疗2 型
DN134 例的临床疗效观察。我们在糖肾胶囊基础上进一步优化,形成了由黄芪、生地、大黄等七味中药组
成的糖肾方,作为益气养阴活血通络法的研究载体,通过药效学、分子生物学及蛋白质学组学技术,进行
了益气养阴活血通络法治疗DN 的药效及作用机制的探讨。
1 益气养阴活血通络法干预DN 的多中心临床疗效评价研究
在973 课题等多项国家课题的支持下,我们与北京、上海、唐山等地7 家三甲医院合作,借鉴国外先
进的循证医学临床疗效评价体系,采用多中心、随机、双盲、安慰剂对照方法开展了益气养阴活血通络法
为基本治则的糖肾方干预气阴两虚夹瘀型2 型__________DN 临床试验。在临床试验中,我们通过采用实验前注册临
床实验方案、履行规范化的标准操作程序、专人实施的临床试验质量监察、由独立统计学家进行的数据管
理和统计分析等方法,保证了临床试验的质量。同时,在本临床试验中,采取了一次性制备试验药物的方
法,突破了既往中医药临床试验中药制剂质量控制的难题;并根据既往对DN 患者常见兼挟证候的调查,
同时制作了加味中药,在基本方基础上由中医师随证加味,既体现了中医辨证论治的特点,又同时兼顾了
RCT 研究中干预措施标准统一的原则,为解决中医个体化治疗与临床疗效评价的标准化、客观化的矛盾提
供了一种新的方法,通过合理整合中西医多种疗效观察指标,包括主要指标(如24 小时尿蛋白定量,尿
白蛋白排泄率)、次要指标(肾功能,血脂指标)及其他指标(中医证候、生存质量、系统生物学指标)
等,建立了中医药治疗DN 的临床疗效评价体系。在临床试验中共纳入临床病例181 例,经连续给药24
周,与安慰剂组相比,发现:糖肾方可以显著降低Ⅲ期患者的尿微量白蛋白排泄率水平和Ⅳ期患者24 小
时尿蛋白定量水平,显著升高Ⅳ期患者血高密度脂蛋白,显著降低Ⅲ期和Ⅳ期患者血肌酐水平和升高估算
的肾小球滤过率的作用;在中医证候疗效指标方面,糖肾方可以显著降低DNⅣ期患者24 周的中医证候总
分及阴虚证候积分。两组不良事件发生率比较差异无统计学意义,综合疗效糖肾方组优于安慰剂组。在以
上实验观察的基础上,我们认为,糖肾方联合西医基础治疗在降低DN 尿白蛋白排泄率、改善脂代谢、保
护肾功能、降低中医证候积分方面具有优于单纯西药治疗的优势。
2 糖肾方对2 型自发性DN 模型OLETF 大鼠的药效学机制研究
我们从国外引进了一种自发性2 型DN 模型—OLETF 大鼠,将OLETF 大鼠分为模型组、糖肾方组和
蒙诺组,与OLETF 大鼠遗传背景相同但不发病的LETO 大鼠作为正常对照组,连续给药至36 和56 周龄。
观察糖肾方对模型大鼠尿蛋白排泄、肾组织病理、血脂及血液流变学指标的影响。结果显示,OLETF 大鼠
24h 尿蛋白随实验周期延长呈渐进性升高,到56 周龄时出现峰值。糖肾方从36 周龄至实验结束的各时间
点均能显著降低模型大鼠24h 尿蛋白,蒙诺组仅在36 周龄与44 周龄对模型大鼠24h 尿蛋白有显著降低作
用,表明糖肾方在降低尿蛋白方面,效果优于蒙诺。与模型组相比,糖肾方组的肾小球硬化指数和肾小管
间质纤维化指数也显著降低。此外,糖肾方还能部分纠正2 型DN 模型OLETF 大鼠的脂代谢紊乱,改善
血液流变学的异常。
我们运用2DE-MALDI-TOF 技术对OLETF 大鼠和遗传背景相似但不发病的LETO 大鼠的肾皮质进行
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了亚差异蛋白质组学研究。与LETO 大鼠相比OLETF 大鼠肾皮质胞浆蛋白中9 个蛋白点(Gapdh, Qdpr, Fah,
similar to Protein C14orf159 mitochondrial precursor, Ephx2, Alb, Acadsb, Clybl)下调,8 个蛋白点(Qdpr, Ephx2,
Fthfd, Tf, Naprt1, Idh1, Fah, Cryab)上调。胞膜蛋白中11 个蛋白点( Uqcrfs1, Nrn1l, Pbld, LOC683519, Calb1,
Acadsb, Dmgdh, Etfb )下调,10 个蛋白点(LOC683519, Qdpr, GMPK, Etfb, Uqcrfs1, Fah, Dmgdh, Gpx3,
cytokeratin 8 polypeptide)上调。这些差异蛋白主要定位在胞浆、线粒体和细胞小泡。能够和离子、维生素、
蛋白结合,其分子功能主要和氧化还原活性、电子传递、转运、抗氧化有关,主要参与细胞信号传导、细
胞凋亡、应激反应和芳香族氨基酸、氧和活性氧代谢过程。其参与的生物学过程包括氧化还原、羧酸代谢、
一元羧酸代谢、急性炎症反应、应激反应、脂肪酸代谢过度表达等。研究中发现ETFb、EPHX2 等9 个不
同的点代表相同的蛋白质,在进一步的研究中发现是编码这些蛋白质基因的个别位点发生了突变,导致了
不同性质氨基酸的取代。通过信息生物学分析这些突变可能在DN 发生发展过程中起着重要作用。
3 糖尿病肾病中医辨证分型和病理分期的代谢组学研究
按照糖尿病肾病临床纳入排除标准筛选了182 例横断面临床样品。按照西医的诊断(Mongensen 病理
分期法)分为5 组:正常组50 例、糖尿病组33 例、糖肾III 期33 例、糖肾IV 期27 例、糖肾V 期39 例。
按照中医辨证分型,可分为正常组50 例,糖尿病组(气阴两虚)33 例,糖尿病肾病气阴两虚组57,糖尿
病肾病阴阳两虚组42 例。为考察阴阳辨证差异,又将糖尿病肾病气阴两虚组分为气阴两虚偏阴虚组(31
例)和气阴两虚偏气虚组(26 例)。采用上述建立的定量代谢组学平台,成功实现了对糖尿病肾病中医辨
证分型和病理分期各类临床病例的聚类区分,说明代谢组学的结果能够正确的反映糖尿病肾病病理进程,
辅助疾病的诊断和中医辨证,另一方面也表明糖尿病肾病中医辨证分型具有科学性并与一定的物质基础相
关联,因此可以借助代谢组学数据和客观的手段实现定性、定量的评价。代谢组学研究发现的多种重要代
谢标志物进一步证实了磷脂代谢通路、脂肪酸代谢通路、嘌呤和嘧啶代谢通路、硫醇氨基酸代谢通路中与
糖尿病肾病的病理病因病机密切相关。
我们分别对DNⅢ、Ⅳ期治疗前、安慰组6 个月和糖肾方治疗6 个月及正常组的代谢指纹谱数据和四
大代谢通路的定量代谢组学数据经MarkerLynx 软件PCA 分析后进行PLS-DA 聚类分析,根据PLS-DA 的
Loading 图可以找出对于样本分类具有重要贡献的代谢物的信息,按照VIP 值排列,这些物质可被认为是
药物干预疾病过程中代谢变化的潜在生物标志物。将所得分子式进行数据库检索,进一步鉴定了糖肾方干
预后的潜在生物学标志物,涉及PC、LysoPC、PE、LysoPE、***、TG、DG 等磷脂类,此外还包括鞘鞍醇
类、甘油二酯、嘌呤和嘧啶类。
4 讨论
与现代医学相比,中医以整体调节和辨证论治为特点,在延缓DN 疾病进展,改善患者生存质量方面
具有一定的优势。但是如何阐明多种成分配伍的有效机制,保障临床安全有效是当前我国中医药研究的一
大难题。转化医学是近年来新兴的一种医学研究模式,强调临床与实验室研究之间双向转化,加强基础研
究与临床医疗的有效联系。系统生物学是转化医学主要的技术支持和理论来源。其体现了分子层次的研究
手段和系统论的方法学的结合,与中医药的整体观有一定的相通性。以系统生物学评价中药复方整体效应,
并开展与整体效应相对应的生物标志物群研究为核心的中药整体效应研究,将为中医药走向国际主流学术
界和国际市场奠定基础。
DN目前治疗手段有限,若不能有效控制进入肾衰竭阶段则治疗费用高昂,给患者家庭和社会带来沉
重经济负担,而以益气养阴活血通络法为主的中医疗法能有效延缓DN的进展,为DN的治疗增加了一个优
选的治疗方法,给临床医生治疗DN提供更好的治疗手段,提高人民的医疗卫生水平和生活质量,从而减
轻患者和社会经济负担,促进社会和谐发展。本研究借鉴国际先进的临床疗效评价方法,将中医临床与系
统生物学、传统药理学等研究手段相结合,建立了中医临床疗效量化表征与系统生物学指标相结合的中医
治疗DN的临床疗效评价方法,获得国际同行的认可,为中医药走向国际奠定基础,同时对中医药治疗其
他疾病临床疗效评价研究具有参考价值。
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